Application of Microsatellite Loci for Molecular Identification of Elite Genotypes, Analysis of Clonality, and Genetic Diversity in Aspen Populus tremula L. (Salicaceae)

Abstract

Systemy testowe do molekularnej identyfikacji elitarnych genotypów osiki (Populus tremula L.) zostały opracowane w oparciu o loci mikrosatelitarne (SSR). Spośród 33 testowanych loci mikrosatelitarnych wybrano 14, ze względu na zrównoważoną amplifikację PCR i znaczną zmienność elitarnych klonów osiki przeznaczonych do zakładania plantacji leśnych o szybkiej rotacji. Wszystkie osiem badanych klonów miało różne genotypy multilocus. Wśród 114 drzew z trzech referencyjnych drzewostanów rodzimych zlokalizowanych w pobliżu założonych plantacji zidentyfikowano 80 haplotypów, a część powtarzających się genotypów przypisano naturalnym klonom, które pojawiły się w wyniku kiełkowania. Wybrany zestaw markerów SSR wykazał wiarygodną identyfikację osobniczą przy niskim prawdopodobieństwie wystąpienia identycznych genotypów osiki (minimum i 1 × 10-4 dla osobników niespokrewnionych i spokrewnionych, odpowiednio). Opisano studia przypadków ilustrujące praktyczne zastosowania systemu badawczego, w tym analizę struktury klonalnej i poziomu zróżnicowania genetycznego w trzech naturalnych drzewostanach osikowych rosnących w regionach, w których założono plantacje z elitarnych klonów.

1. Wprowadzenie

Ciągła degradacja lasów rodzimych na świecie spowodowana nadmierną eksploatacją wymaga wprowadzenia intensywnych form gospodarki leśnej, które sprzyjałyby nie tylko efektowi ekonomicznemu, ale także zachowaniu zasobów genetycznych roślin drzewiastych. Zadanie to zakłada uzyskanie i utrzymanie elitarnych genotypów drzew leśnych przeznaczonych na plantacje leśne o szybkiej rotacji. Nowe wysokoproduktywne i odporne na czynniki abiotyczne, szkodniki i patogeny odmiany i kultywary powstają w wyniku hodowli, selekcji mutacji i/lub inżynierii genetycznej. Klonalne rozmnażanie takich wybitnych osobników zapewnia utrwalenie ich przydatnych cech zarówno do dalszych eksperymentów hodowlanych, jak i do zakładania docelowych plantacji leśnych. W szczególności, rozmnażanie mikroklonalne w kulturach in vitro pozwala na szybkie, wielkoskalowe i opłacalne klonowanie osobników o pożądanych cechach, zwłaszcza gdy tradycyjne pączkowanie lub szczepienie jest niemożliwe lub wymaga specjalnego wysiłku .

Ponieważ morfologicznie i anatomicznie różne klony roślinne mogą wyglądać podobnie, istotne jest wiarygodne zidentyfikowanie tych, w tym odróżnienie ich od siebie i od osobników konspiracyjnych lub przedstawicieli innych blisko spokrewnionych gatunków. W leśnictwie problem identyfikacji osobników jest szczególnie istotny, gdyż wygląd zewnętrzny drzew w dużym stopniu zależy od parametrów środowiska. Na poszczególnych etapach naturalnej ontogenezy drzew leśnych, np. siewek i sadzonek, a zwłaszcza jako kalusa lub eksplantatu w kulturze komórkowej in vitro, osobniki mogą być nierozróżnialne nie tylko indywidualnie, ale także pod względem rozpoznania gatunku. Długi czas generacji i późne dojrzewanie ontogenetyczne stawiają przed roślinami drzewiastymi zadanie genetycznego paszportyzowania elitarnych klonów. Złożony wieloetapowy proces uzyskiwania, rozmnażania i wprowadzania elitarnych odmian na drodze hodowli lub inżynierii genetycznej zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia różnych błędów.

Molekularne markery genetyczne (MGM) okazały się bardzo skutecznym narzędziem do identyfikacji osobniczej. Spośród różnych klas MGM mikrosatelity lub proste powtórzenia sekwencji (SSR) najlepiej odpowiadają wymaganiom systemów testujących do identyfikacji ze względu na ich specyficzność, kodominację, selektywną neutralność, wystarczające bogactwo alleliczne i heterozygotyczność spowodowaną wysokim wskaźnikiem mutacji. Ponadto, ze względu na względny konserwatyzm genomowy w obrębie rodzajów i rodzin roślin, markery SSR i startery PCR do ich amplifikacji mogą być przenoszone z jednego taksonu do drugiego.

W kilku gatunkach topoli, udane odciski palców DNA i różnicowanie klonów, kultywarów i odmian wykazano przy użyciu markerów molekularnych, w tym loci SSR .

W niniejszej pracy donosimy o opracowaniu opartego na SSR systemu testowania do molekularnej identyfikacji genetycznej elitarnych mikropropagowanych genotypów osiki, Populus tremula L., w celu założenia szybko rosnących docelowych plantacji leśnych w kilku regionach Federacji Rosyjskiej oraz przedstawiamy wyniki zastosowania tego systemu do dyskryminacji poszczególnych genotypów, badania struktury klonalnej w naturalnych drzewostanach osikowych i szacowania zmienności genetycznej w populacjach.

2. Materiał i metody

Opracowanie systemu testowego do identyfikacji genotypów elitarnych polegało na wyborze specyficznego zestawu markerów spełniającego wymagania wysokorozdzielczej dyskryminacji klonów oraz przetestowaniu jego wiarygodności i mocy identyfikacyjnej na zestawie genotypów elitarnych i odpowiedniej liczbie przedstawicieli badanego gatunku.

2.1. Materiał roślinny

Elitarne klony osiki i klony mieszańcowe użyte do opracowania systemów testowych do identyfikacji molekularnej zostały uzyskane z mikrorozmnażanych kultur komórkowych utrzymywanych w oddziale Puszczyno Instytutu Chemii Bioorganicznej im. Shemyakina i Ovchinnikova, Rosyjskiej Akademii Nauk (Puszczyno, Rosja). Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.

Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.

Ryc. 1

Mapa lokalizacji plantacji z klonów elitarnych i odpowiadających im rodzimych drzewostanów osikowych użytych jako populacje referencyjne. (1) Prisady, (2) Woroneż i (3) Yoshkar-Ola.

Prisady. Poletko doświadczalne położone 1 km na zachód od osady Prisady w rajonie (okręgu) Serpukhovsky w obwodzie moskiewskim (Rosja). Jako populację referencyjną wykorzystano liście 52 młodych lub w średnim wieku (ok. 10-25 lat) drzew osikowych z naturalnego wielopniowego drzewostanu znajdującego się w bliskiej odległości (1 km) od tej powierzchni.

Voronezh. Próbki pobrano z 17 drzew w drzewostanie przylegającym do powierzchni doświadczalnej założonej w obwodzie woroneskim. Dodatkowe 13 drzew pobrano wzdłuż brzegu rzeki Woroneż w obrębie miasta Woroneż w pobliżu plantacji.

Yoshkar-Ola. Młody rodzimy drzewostan osikowy był źródłem drzew wykorzystanych jako populacja referencyjna dla powierzchni doświadczalnej zlokalizowanej w pobliżu miasta Yoshkar-Ola, Republika Mari-El. Zebrano liście z 32 drzew.

W celu zminimalizowania sporadycznego pobierania próbek z osobników mających pochodzenie wegetatywne (poprzez kiełkowanie) zbierano liście z drzew znajdujących się w odległości nie mniejszej niż 15-20 m od siebie. Takie podejście zostało zastosowane w celu włączenia do prób referencyjnych głównie sadzonek z otwartego zapylenia, charakteryzujących się maksymalną różnorodnością genetyczną. Bazując jednak wyłącznie na wyglądzie zewnętrznym drzew i odległości między nimi, nie można było uniknąć pobierania prób z rozgałęzień pojawiających się w wyniku kiełkowania, co potwierdziły późniejsze analizy genetyczne.

Pędy z liśćmi odcinano za pomocą mechanicznego obcinacza z aluminiowym masztem teleskopowym. Zebrane pędy z liśćmi umieszczano w plastikowych torbach na okres nie dłuższy niż 6 dni w temperaturze +4°С do czasu obróbki. Przygotowanie próbek obejmowało ekstrakcję DNA i umieszczenie rezerwowych fragmentów tkanki liściowej w oznakowanych torebkach typu zip-bag z żelem krzemionkowym do długotrwałego przechowywania. Poza okresem aktywnej wegetacji, uśpione pąki wegetatywne mogą być z powodzeniem wykorzystywane do ekstrakcji DNA.

2.2. Ekstrakcja DNA

Do ekstrakcji DNA użyto fragmentów liści o masie około 350-500 mg pobranych z eksplantatów rosnących in vitro na specjalnym podłożu (REF) w szalkach Petriego.

Dla drzew z populacji rodzimych ekstrahowano DNA z 350-500 mg fragmentów świeżych lub 200-300 mg wysuszonych na krzemionce tkanek liści zmodyfikowaną metodą bromku cetylotrimetyloamoniowego (CTAB) .

2.3. Analiza mikrosatelitarna

Mikrosatelity, lub SSR, reprezentują klasę powtarzających się tandemowo sekwencji DNA o krótkich (1-6 par nukleotydów, bp) motywach różniących się liczbą kopii wśród osobników z powodu wysokiego wskaźnika mutacji. Wielokrotne allele występujące zwykle w kodominujących loci mikrosatelitarnych tworzą dużą różnorodność unikalnych kombinacji genotypowych, co zapewnia ich wiarygodną identyfikację, zwłaszcza przy zastosowaniu odpowiedniej liczby loci. Technicznie, analiza polimorfizmu SSR wymaga jedynie przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), a następnie elektroforezy (żelowej lub kapilarnej) w celu analizy fragmentów. Do opracowania systemu badawczego wybraliśmy wariant metody wykorzystujący jedynie podstawowy sprzęt i proste odczynniki. Zapewniło to zwiększenie powtarzalności procedur w każdym laboratorium PCR oraz pozwoliło na osiągnięcie wysokiej efektywności kosztowej analizy, co jest kluczowe dla praktycznej identyfikacji klonów na dużą skalę.

Ponieważ w literaturze i bazach starterów znaleziono znaczną liczbę jądrowych loci SSR dla topoli, postanowiliśmy wybrać z kilku publikacji i przetestować startery, które mogą być wykorzystane do rutynowej identyfikacji genotypu w oparciu o bardzo prosty sprzęt bez użycia analizatorów DNA. Wstępny zestaw starterów SSR do ich potencjalnego wykorzystania jako elementów systemu testowego identyfikacji molekularnej u osiki powstał w wyniku poszukiwań w bibliograficznych bazach danych (Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/) oraz w Molecular Ecology Resources Primer Database (http://tomato.bio.trinity.edu/).

Amplifikację DNA przeprowadzono przy użyciu zestawów PCRCore (Isogen Laboratories, Ltd., Moskwa, Rosja) w aparacie BioRad Inc. (USA) Dyad Thermo Cycler. Lokalizacje mikrosatelitarne (wymienione w tabeli 2) z serii ORPM i WPMS amplifikowano przy użyciu specyficznych starterów w stężeniu 1 mmol/mL i 5-10 ng docelowego DNA, stosując następujący profil temperaturowy: (1) wstępna denaturacja w temperaturze 94°С przez 3 min; (2) 30 cykli składających się z 30-sekundowej denaturacji w temperaturze 94°С, annealingu primerów w zmiennej temperaturze i czasie (patrz Tabela 3 dla końcowej temperatury annealingu zalecanej po dostosowaniu procedury) oraz elongacji w temperaturze 72°С przez 1,5 min, po czym (3) końcowa elongacja w temperaturze 72°С przez 10 min i (4) schłodzenie mieszaniny PCR do temperatury 4°С.

Locus PCR amplification Fragment size range (bp) Number of alleles Status1 Included in testing system ORPM14 Yes 146–162 4 P No ORPM18 No — — N No ORPM36 Yes 217 1 M No ORPM60 No — — N No ORPM79 No — — N No ORPM81 No — — N No ORPM84 No — — N No ORPM86 Yes 204–216 4 P No ORPM107 No — — N No ORPM117 Yes 218 1 M No ORPM158 Yes 200 1 M No ORPM193 Yes 182–207 6 P Yes ORPM202 Yes 184–193 5 P Yes ORPM206 Yes 190–196 3 P Yes ORPM220 Yes 178–198 5 P Yes ORPM296 Yes 201–183 4 P Yes ORPM312 Yes 189–201 4 P No ORPM366 No — — N No ORPM371 Yes 192–200 3 P No ORPM372 No — — N No ORPM415 Yes ~280 1 M No ORPM484 Yes 190–206 3 P No ORPM488 Yes 197–203 2 P No ORPM496 No — — N No WPMS14 Yes 224–243 3 P Yes WPMS15 Yes 189–207 5 P Yes WPMS16 Yes 139–184 9 P Yes WPMS17 Yes 122–146 7 P Yes WPMS18 Yes 219–248 7 P Yes WPMS19 Yes 210–252 9 P Yes WPMS20 Yes 210–222 4 P Yes WPMS21 Yes 196–240 5 P Yes WPMS22 Yes 115–135 3 P Yes

1P: polymorphic, M: monomorphic, and N: no PCR amplification.

Tabela 3

Wyniki badań loci mikrosatelitarnych u osiki.

Produkty PCR poddano elektroforezie w bloczkach 6% żelu poliakrylamidowego z zastosowaniem systemu buforowego Tris-EDTA-boran. Po elektroforezie żele barwiono w roztworze bromku etydyny i wizualizowano w świetle UV, obrazy graficzne były przechwytywane i zapisywane za pomocą systemu dokumentacji żeli Doc-Print II Vilber Lourmat i przetwarzane w edytorach graficznych. Wielkość fragmentów oceniano za pomocą specjalistycznego oprogramowania (Photo-Capt). Jako markera masy cząsteczkowej użyto DNA plazmidu E. coli pBR322, restryktowanego przez endonukleazę HpaII.

2.4. Analiza statystyczna

Tożsamość klonów została określona przy użyciu analizy dopasowań multilocus dla danych kodominantowych. Prawdopodobieństwo genotypu (GP), oznaczające prawdopodobieństwo pojawienia się danej kombinacji multilokalnej w populacji, oraz prawdopodobieństwo identyczności, szacujące prawdopodobieństwo losowego dopasowania dwóch osobników niespokrewnionych (PI) lub spokrewnionych (PIsib) przez dany zestaw loci, obliczono na podstawie rozkładu częstości alleli w próbkach populacji.

Zgodność obserwowanych rozkładów genotypów dla każdego locus SSR z oczekiwanymi zgodnie z równowagą Hardy’ego-Weinberga testowano za pomocą kryterium chi kwadrat. Dla każdej próby obliczono liczbę alleli oraz obserwowane i oczekiwane heterozygotyczności. Do oceny podziału genetycznego pomiędzy badanymi próbkami populacji wykorzystano statystykę F Wrighta. Wszystkie wyżej wymienione obliczenia wykonano w programie GenAlEx 6.5 dla MS Excel

3. Wyniki i Dyskusja

3.1. Development of SSR-Based Testing Systems for Genotype Identification in Aspen

Do wstępnych testów wybrano 33 heterologiczne tri-, tetra-, penta- i heksanukleotydowe loci mikrosatelitarne z dwóch zestawów; seria ORPM została zaprojektowana najpierw dla Populus trichocarpa, a seria WPMS dla Populus nigra . Charakterystykę tych loci podano w tabeli 2. Wstępne badania przeprowadzono na próbkach DNA trzech klonów (47-1, PtV22 и С-control) z kolekcji in vitro przechowywanej i rozmnażanej w oddziale Puszczyno Instytutu Chemii Bioorganicznej im. Szemjakina i Owczinnikowa, Rosyjskiej Akademii Nauk (Puszczyno, obwód moskiewski, Rosja). Na tym etapie testowano również ich zmienność na 20-24 okazach dzikiej osiki z obwodu nowosybirskiego (Syberia Zachodnia, Rosja) i Kraju Krasnojarskiego (Syberia Środkowa, Rosja).

W wyniku pierwszej fazy badań udało się amplifikować 24 loci, a dziewięć innych loci nie wytworzyło produktów PCR. Spośród 24 loci, które wytworzyły fragmenty PCR, 20 loci okazało się zmiennych z liczbą alleli od dwóch do dziewięciu, podczas gdy cztery loci, które zostały pomyślnie amplifikowane, były monomorficzne (Tabela 3). Po dodatkowych testach przy zmiennych reżimach PCR ostatecznie wytypowaliśmy 14 loci o wiarygodnej amplifikacji i znacznym poziomie polimorfizmu do włączenia do systemu testowego do molekularnej identyfikacji genetycznej. Przykłady zmienności wybranych loci mikrosatelitarnych u osiki przedstawiono na ryc. 2(a) i 2(b).

(a)

(b)

(a)
(b)

Rycina 2

(a) Wzory elektroforetyczne PCR-.amplifikowanych metodą PCR SSR loci ORPM202, ORPM202, ORPM206, ORPM220, ORPM296 i ORPM312 u osiki. Loci: pasy 1-4: ORPM202; pasy 6-9: ORPM206; pasy 10-13: ORPM220; próbki: 1, 6, 10, 15, i 19, osika z populacji rodzimej; 2, 7, 11, 16, i 20, klon С-control; 3, 8, 12, 18, i 21, klon 47-1; 4, 9, 13, 18, i 22, klon PtV22. Łany 5, 14, i 23: marker masy cząsteczkowej DNA (DNA plazmidu E. coli pBR322, trawionego endonukleazą restrykcyjną HpaII). (b) Rozkład elektroforetyczny PCR-amplifikowanych loci SSR WPMS15, WPMS17, WPMS18, WPMS19, WPMS21 i WPMS22 u osiki. Loci: pasy 1-4: WPMS15, pasy 6-9: WPMS17, pasy 10-13: WPMS18, pasy 15-18: WPMS19, pasy 19-22: WPMS21 i pasy 24-27: WPMS22. Próbki: 1, 6, 10, 15, 19, i 24, osika z populacji naturalnej; 2, 7, 11, 16, 20, i 25, klon С-control; 3, 8, 12, 16, 21, i 26, klon 47-1; 4, 9, 13, 18, 22, i 27, klon PtV22. Linie 5, 14, i 23, marker masy cząsteczkowej DNA (DNA plazmidu E. coli pBR322, trawionego endonukleazą restrykcyjną HpaII).

Uzyskane genotypy multilokalne ośmiu klonów elitarnych oraz genotypy referencyjne drzew dzikich z drzewostanów rodzimych zestawiono w Tabeli S1 w Materiałach Uzupełniających dostępnych online na stronie http://dx.doi.org/10.1155/2015/261518. Analizowano do 8 rametów pobranych w różnych fazach rozmnażania mikroklonalnego. W obrębie klonów genotypy były stabilne i jednoznacznie powtarzały się między rametami niezależnie od etapu rozmnażania. Po wykluczeniu rametów o tym samym genotypie, zarówno klony elitarne, jak i genotypy osiki z populacji rodzimych, wchodzące w skład prób referencyjnych, różniły się w 100%. Prawdopodobieństwo wystąpienia genotypów (GP: genotype probability) wśród klonów elitarnych wahało się od 2,4 – 10-21 do 1,7 – 10-11, a wśród drzew w próbach referencyjnych od 4,0 – 10-24 do 5,8 – 10-9. Prawdopodobieństwo sporadycznej zbieżności dwóch niespokrewnionych genotypów (PI: probability of identity) wahało się od 4,8 – 10-10 w Yoshkar-Ola do 4,3 – 10-13 w Prisadach. Dostosowane do teoretycznego prawdopodobieństwa pochodzenia porównywanych osobników od tych samych przodków bardziej konserwatywne oszacowanie (PIsibs) mieściło się w zakresie od 1.0 – 10-4 w Yoshkar-Ola do 9.3 – 10-6 w Woroneżu. Wszystkie wartości są dość niskie, tak że teoretyczna częstość pojawiania się powtarzalnych genotypów na skutek rekombinacji różnych gamet w trakcie reprodukcji nasion nie przekraczała około 1 przypadkowo znalezionej identycznej kombinacji alleli na 10000 porównań. Zależność PI i PIsibs od liczby użytych loci przedstawiona na rysunku 3 wskazuje na praktycznie pomijalne prawdopodobieństwo pojawienia się identycznych genotypów przy zastosowaniu pierwszych 7 do 8 loci wybranych do włączenia do systemu testowego. Wykorzystanie wszystkich 14 loci zapewnia dodatkową wiarygodność i solidność procedury.

Rycina 3

Zależność PI i PIsib od liczby wykorzystanych loci. 1 reprezentuje locus 1, 2 reprezentuje loci 1 + 2, i tak dalej.

Rozwój loci mikrosatelitarnych dla gatunków rodzaju Populus rozpoczął się pod koniec XX wieku wraz z technologiami molekularnych markerów genetycznych. W 1998 roku jeden z pierwszych zestawów starterów do amplifikacji dinukleotydowych loci SSR został zaprojektowany dla amerykańskiej topoli drżącej, Populus tremuloides. W pracy tej wykazano udaną krzyżową amplifikację tych samych markerów dla kilku innych gatunków topoli: P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis i P. maximowiczii. Autorzy postulowali również szerokie spektrum zastosowań loci SSR do różnych celów, w tym identyfikacji klonów, analizy kontrolowanych kojarzeń, mapowania genomu, selekcji wspomaganej markerami, oznaczania różnorodności genetycznej oraz wspierania programów ochrony i zrównoważonego gospodarowania leśnymi zasobami genetycznymi. Kolejne badania dostarczyły osiem innych dinukleotydowych SSR loci dla Populus tremuloides . Od tego czasu loci mikrosatelitarne zostały opracowane dla innych gatunków, w tym P. nigra . Niektóre z tych loci amplifikowano również u P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans i P. lasiocarpa. Specyficzne startery SSR loci zostały zaprojektowane dla Populus euphratica. Zestaw ten został później wykorzystany do opracowania paneli multipleksowych służących do szacowania różnorodności genetycznej tego gatunku .

Sekwencjonowanie następnej generacji było najbardziej efektywną metodą wykrywania powtórzeń tandemowych w genomie topoli i projektowania na ich podstawie przekazywalnych starterów SSR, jak to wykazano w przypadku topoli balsamicznej, Populus trichocarpa . Takie uniwersalne, krzyżowo amplifikowalne loci są wykorzystywane do identyfikacji gatunków i mieszańców oraz do oceny zróżnicowania genetycznego między gatunkami kongeneracyjnymi .

Mikrosatelity są również przydatne do sprawdzania zróżnicowania somaklonalnego w obrębie puli ramet uzyskanych metodą rozmnażania mikroklonalnego z jednego drzewa-dawcy, do identyfikacji poszczególnych klonów w aspekcie ich tolerancji na czynniki środowiskowe. Nie zaobserwowano różnic we wzorach SSR pomiędzy rametami tej samej elitarnej linii klonalnej. Mikrosatelity jądrowe wraz z innymi klasami markerów molekularnych są wykorzystywane także do określania poziomu ploidalności u topoli, a w przypadku kilku genotypów stwierdziliśmy oznaki triploidalności. Triploidalne mieszańce osiki często wykazują zwiększony wigor i odporność na patogeny, dlatego zagadnienie to powinno być przedmiotem dalszych badań z wykorzystaniem analiz kariologicznych i cytometrii pływającej.

3.2. Analiza struktury klonalnej w rodzimych drzewostanach osikowych

Od samego momentu pobierania próbek materiału w dzikich drzewostanach staraliśmy się unikać włączania do badań klonalnych ramet powstałych jako pędy, co jest powszechne dla osiki. We wszystkich badanych drzewostanach zastosowano ten sam schemat pobierania prób, zachowując co najmniej 15-20 m odległości między drzewami. Niemniej jednak, we wszystkich badanych populacjach naturalnych znaleziono ramety tego samego klonu wskazujące na powszechne występowanie rozmnażania wegetatywnego (Tab. S1).

Prisady. Wśród badanych 52 drzew znaleźliśmy 41 różnych haplotypów; jeden genotyp multilocus występował dziewięciokrotnie, a jeden trzykrotnie. Stwierdziliśmy, że te powtarzające się kombinacje multilocus wynikają z pobierania próbek pędów będących rametami tego samego klonu.

Voronezh. Wśród 17 drzew zebranych w bezpośredniej bliskości miejsca prowadzenia plantacji doświadczalnej nie znaleziono osobników klonalnych. Trzynaście drzew zebranych na brzegu rzeki Woroneż reprezentowanych było przez osiem genotypów: cztery z nich występowały w jednym replikancie, trzy okazały się dwoma rametami tego samego klonu, a jeden genotyp występował w trzech egzemplarzach ewidentnie pochodzących z kiełkowania już istniejących progenitorów. W sumie zidentyfikowaliśmy 25 różnych haplotypów w tej próbie populacji referencyjnej.

Yoshkar-Ola. Trzydzieści dwa analizowane drzewa połączyły się w 13 różnych haplotypów zidentyfikowanych przez analizę dopasowań multilocus; jeden genotyp pojawił się dwukrotnie, jeden genotyp pojawił się pięciokrotnie, jeden genotyp pojawił się siedmiokrotnie i jeden genotyp pojawił się dziewięciokrotnie. Powtarzające się genotypy odpowiadają rametom powstałym w wyniku kiełkowania.

Wyciągnęliśmy wniosek, że kiełkowanie i wysoki poziom klonalności są zjawiskiem powszechnym w rodzimych drzewostanach osikowych. U osiki, jak i u wielu innych topoli, klony wegetatywne są w stanie zajmować duże powierzchnie. Dlatego w celu zebrania próby wolnej od powtarzających się genotypów klonów należy zwiększyć odległości między drzewami do co najmniej 40-50 m. Dokładniejsze określenie maksymalnego rozprzestrzenienia pojedynczego klonu na terenie drzewostanu również wymaga specjalnych badań.

Między innymi jądrowe loci SSR były przydatne w badaniach struktury klonalnej i zależności genetycznych między genotypami klonów w drzewostanach rodzimych oraz między drzewostanami rodzimymi i sztucznymi. Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.

3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability

All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).

The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.

Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species . Poziomy wewnątrzpopulacyjnej różnorodności genetycznej obserwowane przez nas w rodzimych drzewostanach osiki mieściły się w zakresie wartości powszechnie obserwowanych u topoli i oszacowanych na podstawie analizy loci SSR (i odnośniki do nich).

Wielka liczba badań wykorzystujących technikę mikrosatelitarną dotyczyła wykrywania hybrydyzacji w naturalnych lub sztucznych drzewostanach topoli. Loci SSR pozwalają na ujawnienie mechanizmów krzyżowania międzygatunkowego i izolacji reprodukcyjnej. W niniejszej pracy skoncentrowano się raczej na zmienności międzyosobniczej i międzypopulacyjnej niż na różnicach międzygatunkowych, ale w odniesieniu do niektórych z badanych klonów elitarnych ich hybrydowe pochodzenie powinno być sprawdzone genetycznie przy użyciu złożonego zestawu markerów o lokalizacji jądrowej i cytoplazmatycznej. Identyfikacja mieszańców międzygatunkowych i klonów przemysłowych z wysoką wiernością została opisana w wielu publikacjach. Godna uwagi jest publikacja dotycząca tożsamości genetycznej niektórych przemysłowych klonów topoli traktowanych wcześniej jako odmienne .

Praktyczne zadanie monitorowania tożsamości klonów komercyjnych w kolekcjach in vitro było podobne do tego, które zastosowano w niniejszych badaniach. We wszystkich zastosowaniach, w których wymagana była wiarygodna identyfikacja osobnicza, SSR wykazały wysoką skuteczność.

4. Wnioski

Zastosowanie jądrowych loci mikrosatelitarnych do identyfikacji genetycznej i oceny zmienności genetycznej elitarnych klonów osiki i drzewostanów rodzimych wykazało wysoką skuteczność opracowanego niskokosztowego systemu badawczego opartego na SSR. Wiarygodna identyfikacja klonów zapewnia genetyczny monitoring rozmnażania mikroklonów i pozwala na wykrycie klonalności w drzewostanach rodzimych. Wykazano, że ten sam zestaw loci mikrosatelitarnych może być z powodzeniem wykorzystany do szacowania poziomu wewnątrz- i międzypopulacyjnej zmienności genetycznej osiki. Rekonstrukcja pokrewieństwa pomiędzy poszczególnymi elitarnymi klonami lub genetycznych relacji naturalnie kojarzących się populacji to zadania perspektywiczne, które mogą być realizowane w przyszłości przy użyciu tych samych markerów.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

Podziękowania

Niniejsze badania są wspierane przez Ministerstwo Edukacji i Nauki Federacji Rosyjskiej (Projekt nr 14.607.21.0044 z dnia 22.08.2014; unikalny identyfikator RFMEFI60714X0044). Autorzy dziękują również E. M. Romanovowi, A. I. Shurginowi, R. V. Sergeevowi (Volga State University of Technology, Yoshkar-Ola, Republic of Mari El, Russia), M. V. Drapalukowi, A. V. Tzaralunga, A. A. Reshetnikovowi, E. O. Kolesnikova (Voronezh State Forestry Engineering University, Voronezh, Russia), and G. B. Kolganikhina (Institute of Forest Science RAS, Uspenskoe, Moscow region, Russia), for their help with sample collection in native stands. Autorzy są również wdzięczni M. Zepsowi, D. Auzenbaha i A. Gailisowi (Łotewski Państwowy Instytut Badawczy Leśnictwa „Silava”, Salaspils, Łotwa) za udostępnienie materiału biologicznego i informacji o elitarnych klonach osiki.

Materiały uzupełniające

.