Opracowano wiele alternatywnych podejść do klonowania PCR (1), w tym klonowanie TA (2), klonowanie niezależne od ligacji (LIC) (3-4), klonowanie zależne od rekombinaz (5-7) oraz klonowanie z zastosowaniem PCR (8-10). Praktyczna przydatność każdej metody klonowania zależy od jej niezawodności, a nie od wygody, ceny czy skuteczności w optymalnych warunkach. Metody, które są najłatwiejsze do monitorowania i optymalizacji, ostatecznie okazują się najbardziej niezawodne. Klonowanie TA i LIC wymaga modyfikacji końców, których nie można monitorować za pomocą elektroforezy żelowej. Rekombinazy są zazwyczaj sprzedawane jako zastrzeżone składniki zestawów do klonowania, więc niewielu konsumentów optymalizuje reakcje rekombinacji in vitro. Opisane tutaj klonowanie PCR z przedłużeniem nakładania nie jest pierwszą formą klonowania z wykorzystaniem PCR (8-10). Jest ono jednak stosunkowo proste, wydajne i niezawodne.
Pierwsza z dwóch reakcji PCR (Rysunek 1A) tworzy liniową wstawkę z sekwencjami plazmidowymi na obu końcach (patrz Materiały uzupełniające w celu zapoznania się z metodami i instrukcjami dotyczącymi projektowania starterów). Rozszerzenia te następnie pozwalają pasmom produktu PCR (Figura 1A) działać jako para nadmiarowych primerów na fragmencie wektora (Figura 1B). Po denaturacji i annealingu, nici wstawki hybrydyzują do wektora i wydłużają się tworząc nowy dwuniciowy plazmid. Polimeraza DNA Phusion (nr kat. F-530; New England BioLabs, Ipswich, MA, USA), kluczowa dla wykonania tej techniki, nie posiada aktywności przemieszczania nici. Dlatego produktem końcowym reakcji jest dwuniciowy plazmid fuzyjny z dwoma nacięciami (po jednym na każdej nici). Ten zrelaksowany dwuniciowy plazmid jest następnie transformowany do kompetentnych komórek Escherichia coli, które zamykają nisze za pomocą enzymów naprawczych DNA (Rysunek 1C). Stosujemy tę samą termostabilną polimerazę do obu PCR, więc niedoświadczeni użytkownicy mogą klonować wydajnie bez konieczności opanowania idiosynkrazji wielu enzymów restrykcyjnych, polimeraz, glikozylaz, rekombinaz i ligaz.
(A) Najpierw insert jest amplifikowany PCR z chimerycznymi starterami tak, że końcowy produkt PCR ma nakładające się regiony z wektorem. (B) Następnie wektor i insercja są mieszane, denaturowane i annektowane; zhybrydyzowana insercja jest następnie przedłużana przez polimerazę Phusion DNA przy użyciu wektora jako szablonu, aż polimeraza osiągnie 5′ koniec insercji. Po kilku cyklach PCR, nowy plazmid z dwoma nacięciami (po jednym na każdej nici) zostaje zgromadzony jako produkt. (C) Nowy plazmid może być transformowany do E. coli po zniszczeniu plazmidu rodzicielskiego przez trawienie DpnI.
Pierwszy raz użyliśmy gfp do eksperymentów typu proof-of-principle. Gen gfp był amplifikowany PCR (Figura 1A) za pomocą starterów chimerycznych (końce 5′ komplementarne do plazmidu pQE30; 3′-koniec komplementarny do gfp). Overlap extension PCR (Rysunek 1B) przeprowadzono przy użyciu pięciu różnych polimeraz DNA (Tabela Uzupełniająca S1). Wysokie stężenia insertu i stosunkowo niskie temperatury annealingu w reakcji (5-10°C poniżej obliczonej temperatury topnienia kompleksu starter/plazmid) są ważne dla wydajnego przedłużania nakładania. Niektóre z produktów PCR odpowiadają zrelaksowanej formie pożądanego wektora, jak wykazała analiza żelu agarozowego (Figura 2A). Oryginalny wektor pQE30 został zniszczony w reakcjach z endonukleazą restrykcyjną DpnI (Rysunek 1C). Niewielką podwielokrotność z każdej reakcji wykorzystano do transformacji komórek E. coli.
(A) Produkty reakcji klonowania PCR z nakładającym się rozszerzeniem po 0, 5, 10, 15, 20, 25 i 30 cyklach za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Trzy nanogramy wektora pQE30 zmieszano z 175 ng insertu (250 molowy nadmiar) w 10 μL całkowitej objętości; 4 μL podwielokrotność reakcji rozdzielono na 0,8% żelu agarozowym. M2, 1 kb DNA ladder; M1, zmontowany plazmid w formie zamkniętej kolistej i zrelaksowanej kolistej. (B) Wydajność klonowania genu gfp metodą overlap extension PCR jako funkcja liczby cykli PCR. Dwadzieścia mikrolitrów kompetentnych komórek E. coli transformowano 1 μL pQE30/insert metodą overlap extension PCR. Liczba zielonych kolonii została wykreślona w zależności od liczby cykli PCR dla każdej płytki. (C) Wydajność klonowania metodą overlap extension PCR jako funkcja długości insertu. Polimeraza DNA Phusion została użyta do amplifikacji produktów o różnych rozmiarach: genu GFP (gfp), genu β-D-glukuronidazy (gusA), genu β-galaktozydazy (lacZ) oraz operonu luxABCDE z nośnego plazmidu pIMBB. Produkty te zostały oczyszczone w żelu i użyte w reakcji PCR z wektorem pQE30 w reakcji overlap extension PCR. Trzy nanogramy wektora pQE30 mieszano z 175-500 ng insertu w całkowitej objętości reakcji 10 μL i poddawano 18 cyklom PCR. Po potraktowaniu DpnI, produkty PCR z przedłużeniem nakładania były wykorzystywane do transformacji kompetentnych komórek E. coli. Liczba kolonii na płytce była porównywana z rozmiarem insertu.
Polimeraza DNA Phusion była lepiej dostosowana do klonowania PCR z rozszerzeniem nakładania niż konkurenci, których testowaliśmy (Tabela uzupełniająca S1), być może ze względu na jej wyższą procesywność i wierność (11-12). Polimeraza DNA Phusion jest 10× bardziej procesywna niż natywna polimeraza Pfu (nr kat. 600135; Stratagene, La Jolla, CA, USA) i wytworzyła 46× więcej kolonii (Tabela uzupełniająca S1). Wytworzyła ona również 35× więcej kolonii niż Expand Long Template DNA polymerase mix (nr kat. 11681834001; Roche, Basel, Szwajcaria), która jest w większości polimerazą Taq DNA. Zuo i Rabie opracowali podobną metodę z użyciem samej polimerazy Taq DNA i odnotowali podobnie skromne wydajności klonowania (8). Polimeraza Taq DNA jest stosunkowo procesywna (60% polimerazy Phusion), ale ogólna wierność mieszaniny wynosi tylko 3,8% polimerazy Phusion. Ponad 98% kolonii transformowanych DNA wytworzonym przez polimerazę DNA Phusion było wyraźnie zielonych, co wskazuje na minimalny błąd klonowania lub przeniesienie oryginalnego wektora.
Pomierzyliśmy wydajność klonowania PCR z rozszerzeniem nakładania jako funkcję cykli temperatury; liczba rekombinowanych klonów rosła geometrycznie podczas pierwszych 15 cykli i osiągnęła szczyt przy 17-18 cyklach (Figura 2B). Dalsze cykle powodowały nieznaczny (~30%) spadek ilości wytwarzanych klonów, związany z akumulacją produktów DNA o dużej masie cząsteczkowej obserwowanych w żelach agarozowych (Rysunek 2A). Stosunek insertu do plazmidu może mieć również znaczący wpływ na wynik reakcji. Porównaliśmy trzy różne proporcje wektor:insert (1:5; 1:50 i 1:250) w reakcji klonowania PCR z nałożonym przedłużeniem przy użyciu polimerazy Phusion DNA. Wszystkie trzy proporcje skutkowały pojawieniem się nicowanej formy plazmidu (jak oceniono przez elektroforezę na żelu agarozowym, nie pokazano) i rekombinowanych klonów (jak oceniono przez transformację i wzrost zielonych kolonii). Stosunek 1:250 dał najwięcej zrekombinowanych klonów.
Potem zastosowaliśmy klonowanie PCR z przedłużeniem nakładki, aby sklonować geny dla GFP (gfp, 1 kb), β-D-glukuronidazy (gusA, 1.9 kb) i β-galaktozydazy (lacZ, 3.2 kb), jak również cały operon luxABCDE (6 kb). Prawidłowa struktura wszystkich zrekombinowanych wektorów została potwierdzona przez analizę restrykcyjną i funkcję białek reporterowych. Pozorny poziom błędu związany z naszą metodą, oceniany na podstawie frakcji kolonii, które nie wykazywały pełnej aktywności reporterowej, wynosił <3% niezależnie od wielkości insertu (dane nie pokazane). Jednocześnie liczba kolonii, które obserwowaliśmy na płytkach po transformacji znacząco malała wraz ze wzrostem długości insertu (Rysunek 2C). Wykres jest prawie liniowy, co sugeruje, że 6,7 kb jest górną granicą dla insertów uzyskanych tą techniką.
Wynik każdego projektu klonowania zależy w dużej mierze od wysiłku pracownika i jego dbałości o szczegóły. Opisana tutaj reakcja klonowania PCR z przedłużeniem nakładania jest równie łatwa do monitorowania i optymalizacji jak każdy inny długi protokół PCR (13). Ogólnie rzecz biorąc, wydajność PCR jest niska, gdy warunki reakcji są zbyt rygorystyczne (primery nie ulegają annealii) lub zbyt swobodne (niespecyficzne primowanie). Oba te zjawiska objawiają się pustymi pasmami w żelach agarozowych, chociaż to drugie może również skutkować powstawaniem rozmazów lub niepożądanych pasm (patrz Materiały Uzupełniające w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat projektowania primerów i optymalizacji reakcji PCR). Surowość reakcji PCR może być kontrolowana poprzez zmianę stężenia reagentów (startery, matryca), temperatury annealingu, składników buforu (magnez, pH, DMSO) lub liczby cykli temperaturowych. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda klonowania okazała się niewrażliwa na obecność wewnętrznych powtarzających się elementów (szczegóły w Materiałach Uzupełniających). Polimeraza DNA Phusion może być użyta do katalizowania zarówno reakcji amplifikacji insertu metodą PCR, jak i reakcji przedłużania nakładania, tak więc praktycy będą musieli zapoznać się jedynie z idiosynkrazjami jednego enzymu.