Złącza szczelinowe w chorobach układu sercowo-naczyniowego

Złącza szczelinowe, wyspecjalizowane struktury błonowe składające się z szeregu kanałów międzykomórkowych, łączą sąsiadujące komórki w wielu tkankach i narządach, zapewniając w ten sposób komunikację chemiczną i elektryczną. W sercu połączenia szczelinowe stanowią drogę dla międzykomórkowego przepływu prądu, umożliwiając skoordynowaną propagację potencjału czynnościowego. Ostatnio ukazało się wiele doniesień sugerujących, że zmiany w rozmieszczeniu, gęstości i właściwościach połączeń szczelinowych mogą być zaangażowane w inicjację i utrzymywanie się różnych zaburzeń rytmu serca. W niniejszym przeglądzie podsumowujemy dane przedstawione w tych doniesieniach i omawiamy implikacje funkcjonalne.

Struktura i właściwości kanałów szczelinowych

W ostatniej dekadzie struktura i właściwości kanałów szczelinowych zostały obszernie udokumentowane, co omówiono w kilku ostatnich przeglądach.1234

Kanały szczelinowe u ssaków zbudowane są z koneksyn kodowanych przez rodzinę blisko spokrewnionych genów. Wszystkie connexiny składają się z 4 wysoce konserwatywnych α-helikalnych segmentów rozprzestrzeniających błonę, oddzielonych 2 pętlami zewnątrzkomórkowymi i 1 wewnątrzkomórkową. Końcówka aminowa i karboksylowa znajdują się wewnątrzkomórkowo. Zidentyfikowano piętnastu członków rodziny connexin u ssaków. Różnią się one głównie sekwencją pętli wewnątrzkomórkowych i zakończeń karboksylowych. W kardiomiocytach na poziomie białkowym wykryto 3 koneksyny: connexin40 (Cx40), connexin43 (Cx43) i connexin45 (Cx45) (ich nazwy pochodzą od ich przypuszczalnej masy cząsteczkowej w kilodaltonach).

Jeden kanał szczelinowy powstaje w wyniku dokowania się dwóch hemichannel (koneksonów), z których każdy składa się z 6 cząsteczek koneksyny ułożonych heksagonalnie wokół wodnego porów. Ponieważ dokowanie odbywa się za pośrednictwem względnie konserwowanych pętli zewnątrzkomórkowych, wiele koneksonów zbudowanych z jednego rodzaju koneksyn może łączyć się z koneksonami zbudowanymi z innych koneksyn, tworząc heterotypowe kanały szczelinowe. Konekson może również składać się z różnych koneksyn5 (konekson heteromeryczny). W sercu różne connexiny kolokalizują się w blaszkach gap junction, ale nie wiadomo, czy heterotypowe i/lub heteromeryczne kanały gap junction istnieją w układzie sercowo-naczyniowym.

Kanały gap junction są przepuszczalne dla substancji o masie cząsteczkowej <≈1 kDa. Przepuszczalność zależy od typu koneksyn i ładunku cząsteczki przenikającej. Kanały Gap Junction zachowują się jak bramkowane kanały jonowe. W kardiomiocytach przewodnictwo pojedynczego kanału waha się od ≈20 pS dla homotypowych kanałów Cx45 do 75 pS dla kanałów Cx43 i do ≈200 pS dla kanałów Cx40. Konduktancja połączenia szczelinowego jest modulowana przez napięcie transjunkcjonalne, przez i6 oraz i, przez stan fosforylacji koneksyn oraz przez skład zewnątrzkomórkowych kwasów tłuszczowych.

Modulowana jest również ekspresja koneksyn. Hormony mogą zwiększać lub zmniejszać zawartość koneksyn. W komórkach serca szczura noworodka in vitro, cAMP może drastycznie zwiększyć ekspresję Cx43 z jednoczesnym zwiększeniem prędkości przewodzenia potencjału czynnościowego. Rotacja connexin jest niezwykle szybka. Na przykład w sercu dorosłego szczura okres półtrwania wynosi 1,3 godziny.7

Rozkład połączeń szczelinowych w prawidłowym mięśniu sercowym

W mięśniu sercowym koneksyny ulegają regionalnej ekspresji: Cx43 występuje w całym sercu, z możliwym wyjątkiem tkanek węzłowych i części układu przewodzącego.4 U ssaków Cx40 ulega ekspresji w tkance przedsionków (z wyjątkiem serca szczura) i w proksymalnym układzie przewodzącym (z wyjątkiem serca świnki morskiej).89 Ekspresja Cx45 wydaje się być ograniczona do tkanek węzłowych i układu przewodzącego,1011 ale niektóre doniesienia1213 mówią o znacznie szerszym rozmieszczeniu, prawdopodobnie z powodu użycia nie w pełni specyficznego przeciwciała anty-Cx45.14 Jak dotąd nie wykryto innych koneksyn między kardiomiocytami.

W dorosłych komorach serca połączenia szczelinowe zawierają wyłącznie Cx438 i są zlokalizowane głównie w regionie tarczy międzykomórkowej (ID) między komórkami. Anizotropowe właściwości przewodzące mięśnia sercowego komór zależą od geometrii połączonych komórek oraz liczby, wielkości i lokalizacji blaszek połączeń szczelinowych między nimi.15 W wielu badaniach (immuno)-histochemicznych i (elektrono)mikroskopowych zajmowano się tymi zagadnieniami. Płytki szczeliny łączącej składają się z tablic mniej lub bardziej ściśle upakowanych 9- do 10-nm cząsteczek, reprezentujących poszczególne kanały. W normalnych warunkach blaszki szczeliny łączącej szczura wydają się zawierać ≈15% przestrzeni wolnej od cząstek,16 podczas gdy blaszki szczeliny łączącej królika są przylegające.17 Jeśli chodzi o przewodnictwo połączenia, różnica jest niewielka, ponieważ mniejsza liczba kanałów na mikrometr kwadratowy jest w dużym stopniu równoważona przez zmniejszenie oporu dostępu18 (patrz poniżej). Średnia powierzchnia blaszki gap junction waha się od 0,21 μm2 w komorze człowieka19 do ≈0,45 μm2 w komorze szczura2021 i do ≈4 μm2 w komorze psa.22 W tym ostatnim przypadku powierzchnia ta wynosiła ≈1,5 μm2 dla około połowy blaszek i ≈6,6 μm2 dla drugiej połowy. Z oceny (elektronowo)mikroskopowej212223 i (immuno)histochemicznej,1921242526 wynika, że większe płytki gap junction znajdują się w regionach międzypłatkowych ID (tj. w regionach biegnących mniej więcej równolegle do długiej osi komórek), a mniejsze znajdują się w regionach płatkowych. Hoyt i wsp.22 oszacowali, że 80% całkowitej powierzchni blaszek gap junction przypadającej na komórkę znajduje się w regionach międzypłatowych, gdzie połączenia gap junctions mogą służyć zarówno przewodzeniu podłużnemu, jak i poprzecznemu.

Miocyty komorowe są połączone przez ID z ≈10 sąsiednimi komórkami.2226 Prędkość przewodzenia jest określana przez powierzchnię blaszek gap junction w każdym z tych ID. Całkowita powierzchnia blaszek gap junction na ID wynosi od 47 do 94 μm2 u szczurów,27 42 lub 13,6 μm2 u psów,2223 i ≈10 μm2 u ludzi.26

W przedsionku blaszki gap junction zawierają zarówno Cx43, jak i Cx40.913 Najczęściej Cx43 i Cx40 są zlokalizowane w tych samych blaszkach, bez preferencyjnej lokalizacji którejkolwiek z connexin w bocznych granicach komórek lub blaszkach ID.9 Brak danych pozwalających na obliczenie powierzchni blaszek gap junction przypadającej na ID w przedsionku.

W mięśniu sercowym komór ekspresja Cx40 jest ograniczona do układu przewodzącego.8 U większości gatunków ssaków Cx43 nie występuje w części proksymalnej (pęczek Hisa, gałęzie pęczkowe), natomiast w bardziej dystalnych regionach gałęzi pęczkowych i włókien Purkinjego Cx40 i Cx43 ulegają koekspresji.28 W oocytach Xenopus, Cx43 i Cx40 nie mogą tworzyć funkcjonalnych heterotypowych kanałów gap junction,29 i sugerowano, że dystrybucja connexin w proksymalnym układzie przewodzącym służyłaby do szybkiej propagacji potencjału czynnościowego do części dystalnych bez utraty prądu przez gap junctions do otaczających miocytów przegrodowych. Jednak w komórkach ssaków niezgodność koneksonów Cx40 i Cx43 wydaje się mniej jednoznaczna.30 W sercach myszy Cx45 ulega ekspresji w całym węźle przedsionkowo-komorowym, pęczku Hisa i gałęziach pęczkowych.10 Ekspresja Cx40 jest ograniczona do rdzenia pęczka Hisa i gałęzi pęczkowych.10

Dystrybucja połączeń szczelinowych w chorym mięśniu sercowym

W praktycznie wszystkich chorobach serca predysponujących do arytmii odnotowano zmiany w rozmieszczeniu i liczbie połączeń szczelinowych (remodeling połączeń szczelinowych). W zaawansowanej chorobie niedokrwiennej wykryto wąską strefę składającą się z ≈5 warstw komórek graniczących z zagojonymi zawałami mięśnia sercowego.24 W tej strefie normalny rozkład połączeń szczelinowych w położonych od końca do końca ID został zaburzony z przesunięciem plamek zawierających Cx43 do bocznych granic komórek bez zmian w wielkości plamek. Prawidłowe, niedokrwienne i przerośnięte ludzkie lewe komory wykazywały jednakowej wielkości blaszki barwienia anty-Cx43, ale całkowita ilość Cx43 była zmniejszona o 40% w chorych sercach.26 Liczba ID na komórkę nie różniła się w normalnych i chorych sercach, co sugeruje, że geometria komórkowa nie uległa dramatycznej zmianie. Z drugiej strony, w odwracalnie niedokrwionej i hibernującej ludzkiej komorze zaobserwowano zmniejszenie rozmiaru blaszki Cx43 o 23% i 33%, odpowiednio, w dotkniętych regionach,19 bez zmian w normalnym mięśniu sercowym. W tych eksperymentach zaobserwowano przesunięcie plamek Cx43 z lokalizacji od końca do końca do lokalizacji bocznej; takie przesunięcie odnotowano również w kardiomiopatii przerostowej.25

W modelu zastoinowej niewydolności serca na świnkach morskich zaobserwowano ogólną redukcję Cx43 o 37% w stadium zastoinowej niewydolności serca po 6 miesiącach bandażowania aorty, podczas gdy w stadium skompensowanego przerostu nie zaobserwowano żadnych zmian.31 Ostatnio po 4 tygodniach przerostu prawej komory spowodowanego nadciśnieniem płucnym wywołanym przez monokrotalinę u szczura stwierdzono zmniejszenie powierzchni szczeliny międzykomorowej (gap junction area per ID)32 o 35%, przy jednoczesnym zmniejszeniu prędkości przewodzenia podłużnego (ΘL) o 30%. Równocześnie wzdłuż bocznych granic komórek pojawiły się liczne miejsca Cx43-pozytywne. Prędkość przewodzenia w kierunku poprzecznym (ΘT) oraz całkowita zawartość Cx43, oceniana metodą immunoblottingu, nie uległy zmianie. Autorzy doszli do wniosku, że redystrybucja blaszek gap junction może tłumaczyć zmniejszony stosunek anizotropii (ΘL/ΘT). Jednak obserwowany wzrost średnicy komórek o 55% może również odgrywać pewną rolę. Peters i wsp.33 wykazali ścisłą korelację pomiędzy indukowalnością arytmii reentry figury 8 w tkance nasierdziowej graniczącej z 4-dniowym zawałem w komorach psich a zaburzeniem dystrybucji połączeń szczelinowych. Szczególnie żywotne komórki znajdujące się w pobliżu, a czasem w interdigitacji z komórkami martwiczymi obszaru zawału, wykazywały rozległe znakowanie Cx43 na bocznych granicach komórek.

Wydaje się, że lateralizacja połączeń szczelinowych jest istotną cechą chorego mięśnia sercowego. Nie jest jednak całkowicie jasne, w jakim stopniu ta lateralizacja może przyczyniać się do zmienionych właściwości przewodzenia, ponieważ niedawno wykazano34 , że w komórkach komory szczura graniczących z zagojonymi zawałami, wiele z bocznych blaszek połączeń szczelinowych znajduje się w inwazji sarkolemmy do wnętrza komórki, nie przyczyniając się w ten sposób do komunikacji międzykomórkowej. Podobną obserwację poczyniono w przeroście prawej komory.32

Ale dane ilościowe są skąpe, innym powszechnym zjawiskiem w chorym mięśniu sercowym jest zmniejszenie powierzchni szczeliny międzykomórkowej o 30% do 40% w przeliczeniu na ID. W komorach (po)niedokrwiennych redukcja ta jest ograniczona do kilku warstw komórek wokół uszkodzonego obszaru, natomiast w komorach przerostowych redukcja ta jest bardziej rozległa. Na podstawie tej obserwacji, samej lub w połączeniu ze zwiększoną gęstością blaszek połączenia bocznego gap junction, można by przewidzieć zmniejszony współczynnik anizotropii. W jednym z badań,23 sugerowano, że zwiększony współczynnik anizotropii występuje w strefach granicznych zawału. Wzrost ten wynikał częściowo ze zmniejszenia gęstości bocznych (międzypłatowych) połączeń szczelinowych, a częściowo ze zmniejszenia liczby komórek mających połączenia boczne z komórkami sąsiednimi.

Zmiany gęstości i rozmieszczenia połączeń szczelinowych w chorej tkance przedsionkowej są mniej dobrze udokumentowane. W szybko stymulowanych przedsionkach psów odnotowano wzrost liczby miejsc Cx43-pozytywnych,35 zwłaszcza na bocznych granicach komórek. W przedsionku kozy nie stwierdzono widocznych zmian w gęstości i rozmieszczeniu Cx43 po 16 tygodniach utrzymującego się migotania przedsionków (AF),3637 chociaż doszło do pewnej dephosphorylacji. Białko Cx40 było nieobecne w 0,15- do 0,6-mm płatach tkanki przedsionkowej po 16 tygodniach AF bez redukcji Cx40 mRNA. Fragmentaryczna redukcja białka Cx40 była widoczna po 2 tygodniach AF, mniej więcej w tym samym czasie, gdy AF stało się trwałe. Nie wiadomo, czy ta redukcja Cx40 jest przyczynowo związana z utrzymywaniem się AF.

Dane dotyczące udziału remodelingu połączenia szczelinowego w arytmiach pochodzących z układu przewodzącego lub tkanki węzłowej dopiero zaczynają być opisywane.383940

Złącza szczelinowe i prędkość przewodzenia

Efektywne gj

Przeprowadziliśmy kilka prostych symulacji komputerowych, aby sprawdzić wpływ zmian w gęstości i rozmieszczeniu połączeń szczelinowych na prędkość przewodzenia potencjału czynnościowego. Po pierwsze, określiliśmy efektywną konduktancję połączeń szczelinowych (gj, skorygowaną o efekty pola elektrycznego spowodowane oporem dostępu do cytoplazmy) za pomocą naszego wcześniej opublikowanego modelu18 i zakładając, że przewodność pojedynczego kanału Cx43 wynosi 75 pS w temperaturze 37°C41 i wszystkie kanały są w stanie przewodzenia (ale patrz odnośnik 42 ). Rysunek 1A pokazuje, że efekty oporu dostępu do cytoplazmy są już widoczne dla stosunkowo małych szczelin i stają się bardziej widoczne wraz ze wzrostem rozmiaru szczeliny. Dla szczelinowych połączeń >0.5 μm2, efektywna konduktancja wynosi <50% wartości uzyskanej przez proste zsumowanie indywidualnych konduktancji wszystkich kanałów w danym obszarze (konduktancja nieskorygowana), a dla szczelin junctions >4 μm2, efektywna konduktancja wynosi nawet <20%. W związku z tym, gj na jednostkę powierzchni nie jest stałe, ale maleje wraz ze wzrostem rozmiaru złącza szczelinowego (Rysunek 1B). Efektywna przewodność wynosi 0,3 do 0,5 μS/μm2 dla małych i umiarkowanie dużych szczelin (0,3 do 1,5 μm2) i <0,2 μS/μm2 dla dużych szczelin (>5 μm2). Jak omówiono powyżej, powierzchnia złącza szczelinowego zwykle waha się między 10 a 40 μm2 na ID. Jeśli użyjemy średniej efektywnej konduktancji 0,3 μS/μm2, efektywne gj na ID pomiędzy sąsiadującymi komórkami wynosi 3 do 12 μS.

Szybkość przewodzenia

Następnie oceniliśmy znaczenie gj dla szybkości przewodzenia. Pobudziliśmy najbardziej wysuniętą na lewo komórkę w liniowym paśmie 50 komórek z częstotliwością 1 Hz i obliczyliśmy prędkość przewodzenia przez środkową jedną trzecią pasma. Komórki były ułożone albo koniec do końca, albo obok siebie, a sąsiednie komórki były połączone przez stałą (efektywną) gj (Rycina 2A). Zastosowaliśmy model ludzkiej komórki komorowej Priebe i Beuckelmanna43 w numerycznej reprezentacji równania kabla podobnej do tej badanej przez Shaw i Rudy’ego,44 z wartością 150 Ω cm dla oporności cytoplazmatycznej.45

Aby uzyskać wartości ΘL wynoszące ≈70 cm/s, jak podano dla ludzkich komór,46 wymagana jest konduktancja 7,0 μS (Rysunek 2B). Zgadza się to dobrze z powyższą wartością od 3 do 12 μS oszacowaną na podstawie danych morfometrycznych. To samo przewodnictwo wynoszące 7,0 μS skutkuje ΘT równym 30 cm/s. W normalnych warunkach ΘL jest dość mało wrażliwa na zmiany gj: zmniejsza się tylko o 9 cm/s (13%) przy zmniejszeniu konduktancji o połowę. ΘT jest bardziej wrażliwa na zmiany gj: zmniejsza się o 36% przy zmniejszeniu konduktancji o połowę. Względna niewrażliwość ΘL na zmiany gj może być wyjaśniona w kategoriach rezystywności szczeliny, którą obliczyliśmy na podstawie gj i wymiarów komórki (rys. 2C). Dla przewodnictwa podłużnego (linia ciągła z wypełnionymi okręgami na Rysunku 2C), oporność złącza szczelinowego spada poniżej oporności cytoplazmatycznej 150 Ω cm (pozioma linia przerywana) przy wartościach gj tak małych jak 2,5 μS, podczas gdy dla przewodnictwa poprzecznego, oporność złącza szczelinowego jest znacznie większa niż oporność cytoplazmatyczna przy wszystkich wartościach gj (linia przerywana z otwartymi kwadratami). Stąd wniosek, że prędkość przewodzenia, szczególnie ΘL, jest tylko umiarkowanie wrażliwa na zmiany efektywnej gj. Ponadto, wymiary komórki (stosunek długości komórki do jej szerokości) mogą odgrywać istotną rolę w określaniu (anizotropii) prędkości przewodzenia. Jest to zgodne z wnioskiem Spacha i wsp.47, że rozmiar komórek może być ważniejszy niż dystrybucja połączeń szczelinowych.

Wskazania funkcjonalne

Wyniki symulacji stanowią ważne zastrzeżenia dla interpretacji danych ilościowych z badań (immuno)histochemicznych lub (elektrono)mikroskopowych. Zmniejszenie całkowitej zawartości szczeliny międzykomórkowej aż o 40% bez zmian w wielkości blaszek szczeliny międzykomórkowej, co zaobserwowano w chorych sercach ludzkich26 , może samo w sobie mieć jedynie umiarkowany wpływ na prędkość przewodzenia. Jeśli normalna gj między komórkami wynosi 5 μS, redukcja o 40% do 3 μS skutkuje 11% spadkiem ΘL z 65 do 58 cm/s i 27% spadkiem ΘT z 24 do 18 cm/s (ryc. 2B). Związany z tym współczynnik anizotropii wzrasta o 22% z 2,7 do 3,3. W innych przypadkach ogólna zawartość szczelin pozostała niezmieniona, ale nastąpiło przesunięcie w kierunku bocznych granic komórek.2532 Przesunięcie o 40% zmniejszyłoby ΘL o 11% i zwiększyłoby ΘT o 25%, co spowodowałoby spadek współczynnika anizotropii o 29%. Jeśli nowe boczne połączenia szczelinowe są zlokalizowane wewnątrzkomórkowo,3234 ΘT może się w ogóle nie zmienić.

Uwagi końcowe

W wielu badaniach dotyczących przebudowy połączeń szczelinowych w chorej tkance komorowej autorzy doszli do wniosku, że zmniejszenie prędkości przewodzenia może zwiększać skłonność do arytmii reentrycznych. Jednak obecna analiza ograniczonej liczby dostępnych danych wskazuje, że zmniejszenie prędkości przewodzenia lub zmiany współczynnika anizotropii mogą być w rzeczywistości umiarkowane. Z pewnością obserwowane zmiany nie doprowadziłyby podłoża do sfery powolnego przewodzenia, o którym mowa w kilku ostatnich badaniach eksperymentalnych484950 i teoretycznych4451. Nasza analiza wskazuje, że oporność cytoplazmatyczna i geometria komórkowa są znacznie ważniejsze niż powszechnie uświadamiane, co jest wnioskiem popieranym również przez Spacha i współpracowników.15475253

Nie uwzględniliśmy w naszej analizie wywołanych chorobą zmian w błonowych właściwościach jonowych i kanałach szczelinowych. Niewątpliwie takie zmiany patofizjologiczne jeszcze bardziej komplikują zrozumienie arytmogenezy w ostrym niedokrwieniu, przewlekłym zawale serca, przeroście i niewydolności serca.

Przypisy