p>P>Numerosas abordagens alternativas à clonagem PCR (1) foram desenvolvidas, incluindo a clonagem TA (2), a clonagem independente da ligadura (LIC) (3-4), a clonagem dependente da recombinação (5-7), e a clonagem mediada por PCR (8-10). A utilidade prática de qualquer método de clonagem é baseada em sua confiabilidade, em vez de sua conveniência, preço ou eficiência sob condições ideais. Os métodos que são mais fáceis de monitorar e otimizar são os mais confiáveis. A clonagem TA e a PBR requerem modificações finais que não podem ser monitoradas por eletroforese em gel. Recombinases são geralmente vendidas como componentes proprietários de kits de clonagem, por isso poucos consumidores otimizam as reações de recombinação in vitro. A clonagem por PCR de extensão sobreposta, descrita aqui, não é a primeira forma de clonagem mediada por PCR (8-10). Contudo, é relativamente simples, eficiente e fiável.
A primeira de duas PCRs (Figura 1A) cria um inserto linear com sequências de plasmídeos em ambas as extremidades (ver Materiais Suplementares para métodos e instruções para o desenho do primário). Estas extensões permitem subsequentemente que as cordas do produto PCR (Figura 1A) actuem como um par de iniciadores sobredimensionados no fragmento vectorial (Figura 1B). Após desnaturação e recozimento, os cordões de inserção hibridizam para o vector e estendem-se para formar um novo plasmídeo de fio duplo. A Phusion DNA polimerase (Cat. no. F-530; New England BioLabs, Ipswich, MA, EUA), crucial para o desempenho da técnica, não possui atividade de deslocamento de cordões. Portanto, o produto final da reação é um plasmídeo de fusão de duas cordas com dois nicks (um em cada cordão). Este plasmídeo de dupla cadeia relaxada é então transformado em células competentes de Escherichia coli, que selam os nicks com enzimas de reparação de DNA (Figura 1C). Utilizamos a mesma polimerase termoestável para ambas as PCRs, para que os usuários inexperientes possam clonar eficientemente sem dominar as idiossincrasias de múltiplas enzimas de restrição, polimerases, glicosilases, recombinases e ligases.
(A) Primeiro, o inserto é amplificado com os primers quiméricos para que o produto final da PCR tenha regiões sobrepostas com o vetor. (B) Em seguida, o vector e o insert são misturados, desnaturados e recozidos; o insert hibridizado é então estendido pela Phusion DNA polimerase usando o vector como modelo até que a polimerase chegue ao final do insert em 5′. Após vários ciclos de PCR, o novo plasmídeo com dois nicks (um em cada filamento) é acumulado como um produto. (C) O novo plasmídeo pode ser transformado em E. coli após o plasmídeo parental ser destruído pelo DpnI digest.
Usamos pela primeira vez o gfp para experiências de prova de princípio. O gene gfp foi amplificado por PCR (Figura 1A) com os primers quiméricos (5′ termina complementarmente ao plasmídeo pQE30; 3′- termina complementarmente ao gfp). A PCR de extensão sobreposta (Figura 1B) foi realizada com cinco polimerases de DNA diferentes (Tabela Suplementar S1). Concentrações elevadas da pastilha e temperaturas de recozimento relativamente baixas na reacção (5-10°C abaixo da temperatura de fusão calculada do primário/ complexo plasmídeo) são importantes para uma extensão de sobreposição eficiente. Alguns dos produtos da PCR correspondem à forma relaxada do vector desejável, como revelado pela análise com gel de agarose (Figura 2A). O vector pQE30 original foi destruído em reacções com endonuclease de restrição DpnI (Figura 1C). Uma pequena alíquota de cada reação foi usada para transformar células de E. coli.
(A) Produtos da extensão de sobreposição da reação de clonagem PCR após 0, 5, 10, 15, 20, 25, e 30 ciclos por eletroforese em gel de agarose. Três nanogramas do vetor pQE30 foram misturados com 175 ng de inserção (excesso de 250 molares) em 10 μL volume total; uma alíquota de 4-μL de reação foi separada em um gel de agarose 0,8%. M2, 1 kb DNA ladder; M1, plasmídeo montado em formas circulares fechadas e circulares relaxadas. (B) Eficiência de clonagem por PCR de extensão sobreposta de um gene gfp em função do número de ciclos de PCR. Vinte microlitros de células E. coli competentes foram transformadas com 1 μL pQE30/insert extensão de sobreposição PCR. O número de colónias verdes foi plotado em função do número de ciclos de PCR para cada placa. (C) Eficiência da clonagem PCR de extensão de sobreposição em função do comprimento do inserto. A Phusion DNA polimerase foi utilizada para amplificar os produtos de vários tamanhos: gene GFP (gfp), gene β-D-glucuronidase (gusA), gene β-galactosidase (lacZ), e o operon luxABCDE do plasmídeo portador do pIMBB. Estes produtos foram purificados com gel e utilizados na extensão de sobreposição da reacção PCR com o vector pQE30. Três nanogramas do vector pQE30 foram misturados com 175-500 ng de inserção num volume total de reacção de 10 μL e submetidos a 18 ciclos de PCR. Após o tratamento DpnI, os produtos de PCR de extensão sobreposta foram utilizados para transformar as células de E. coli competentes. O número de colônias por placa foi plotado em relação ao tamanho do inserto.
Phusion DNA polimerase was better suited for overlap extension PCR cloning than the competitors we tested (Supplementary Table S1), perhaps due to its superior processivity and fidelity (11-12). A Phusion DNA polimerase é 10× mais processiva que a Pfu polimerase nativa (Cat. no. 600135; Stratagene, La Jolla, CA, EUA), e produziu 46× mais colônias (Tabela Suplementar S1). Também produziu 35× mais colônias do que a mistura de DNA polimerase de modelo longo (Cat. No. 11681834001; Roche, Basiléia, Suíça), que é em sua maioria Taq DNA polimerase. Zuo e Rabie desenvolveram um método similar apenas com Taq DNA polimerase, e relataram eficiências de clonagem igualmente modestas (8). A Taq DNA polimerase é relativamente processiva (60% da Phusion), mas a fidelidade geral da mistura é de apenas 3,8% da Phusion. Mais de 98% das colónias transformadas com ADN produzido pela Phusion DNA polimerase eram visivelmente verdes, indicando um erro mínimo de clonagem ou de transporte do vector original.
Medimos a eficiência da extensão da sobreposição da clonagem por PCR em função dos ciclos de temperatura; o número de clones recombinantes aumentou geometricamente durante os primeiros 15 ciclos e atingiu um pico de 17-18 ciclos (Figura 2B). Outros ciclos resultaram numa ligeira diminuição (~30%) na quantidade de clones produzidos, associada à acumulação dos produtos de ADN de elevado peso molecular observados nos géis de agarose (Figura 2A). A relação inserção/plasma pode também ter um efeito pronunciado no resultado da reacção. Comparamos três diferentes razões vector:insert (1:5; 1:50 e 1:250) na reacção de clonagem PCR de extensão sobreposta com a Phusion DNA polimerase. Todas as três razões resultaram no aparecimento da forma nicked do plasmídeo (a julgar pela electroforese em gel de agarose, não mostrado) e clones recombinantes (a julgar pela transformação e crescimento das colónias verdes). A razão 1:250 produziu os clones mais recombinantes.
Aplicamos então a clonagem PCR de sobreposição para clonar os genes para GFP (gfp, 1 kb), β-D-glucuronidase (gusA, 1,9 kb), e β-galactosidase (lacZ, 3,2 kb), assim como todo o operon luxABCDE (6 kb). A estrutura correta de todos os vetores recombinantes foi confirmada pela análise de restrição e função da proteína repórter. A taxa de erro aparente associada ao nosso método, avaliada pela fração das colônias que não exibiram atividade repórter completa, foi <3% independentemente do tamanho da inserção (dados não mostrados). Ao mesmo tempo, o número de colônias que observamos nas placas após a transformação diminuiu consideravelmente com o aumento do comprimento da pastilha (Figura 2C). O gráfico é quase linear, o que sugere que 6,7 kb é o limite superior para inserções com esta técnica.
O resultado de qualquer projeto de clonagem depende em grande parte do esforço e atenção ao detalhe do trabalhador. A extensão de sobreposição da reacção de clonagem PCR descrita aqui é tão fácil de monitorizar e optimizar como qualquer outro protocolo de PCR longo (13). Em geral, os rendimentos da PCR são fracos quando as condições de reacção são demasiado rigorosas (os iniciadores não conseguem recoagir) ou demasiado relaxadas (iniciadores não específicos). Ambos são manifestados por pistas vazias em géis de agarose, embora estes últimos também possam resultar em manchas ou bandas indesejáveis (Ver Materiais Suplementares para detalhes sobre o desenho do primer e a optimização da reacção PCR). O rigor da PCR pode ser controlado através da alteração das concentrações dos reagentes (primários, molde), temperatura de recozimento, ingredientes tampão (magnésio, pH, DMSO) ou do número de ciclos de temperatura. Em geral, esta abordagem de clonagem revelou-se insensível à presença dos elementos internos repetidos (ver Materiais Suplementares para mais detalhes). A Phusion DNA polimerase pode ser usada para catalisar tanto a amplificação da PCR do inserto como as reacções de extensão da sobreposição, pelo que os praticantes apenas terão de se familiarizar com as idiossincrasias de uma única enzima.