Una dintre cele mai durabile contribuții ale lui Winthrop la colonia din Golful Massachusetts a fost faptul că s-a bazat foarte mult pe religie. În timp ce se aflau încă la bordul vasului Arbella, Winthrop și ceilalți fondatori și-au expus speranțele religioase pentru noua colonie într-un document numit „Modelul de caritate creștină”. În acesta, el a expus modul în care puritanii vor rămâne puri, astfel încât Dumnezeu să continue să-i binecuvânteze pe coloniști în timp ce aceștia își așteaptă șansa de a se întoarce și de a salva Anglia de la focul etern al iadului. El a repudiat Biserica Angliei, ierarhia și ceremoniile acesteia. Cu toate acestea, au mers pe o linie fină, deoarece regele ar fi revocat carta dacă ar fi descoperit că au renegat credința anglicană.
Pentru a păstra sfințenia noii colonii, disciplina a devenit una dintre cele mai mari probleme în rândul grupului religios, o mare parte din aceasta fiind realizată la nivel familial. De fapt, disciplina familială a devenit atât de importantă încât colonia a interzis oricui să locuiască singur,iar bărbaților și femeilor singure li se cerea să se mute cu alte familii.Problemele care erau prea mari pentru a fi controlate de o familie – cele care afectau întreaga comunitate – ajungeau în fața Tribunalului General pentru a fi luate în discuție – colonia temătoare de Dumnezeu suferea de influența diavolului. Winthrop a înregistrat cu grijă în jurnalul său fărădelegile colegilor săi coloniști. Răsplata a fost întotdeauna rapidă și aspră. De exemplu, într-unul dintre cele mai bizare cazuri, George Spencer a fost executat după ce unul dintre porcii săi a fătat un purceluș cu asemănări umane. „Sfinților” din noua colonie le-a fost ușor să pronunțe judecăți aspre împotriva păcătoșilor din rândul lor, deoarece știau că judecata lui Dumnezeu va fi la fel de rapidă. Dacă în Anglia biserica și Dumnezeu făcuseră parte din viața de zi cu zi, în Noua Lume coloniștii au făcut în mod intenționat acest lucru întreaga lor viață.
Prima biserică din Massachusetts, o biserică congregațională din Salem, a fost fondată cu un an înainte de sosirea grupului lui Winthrop. Până în 1635 existau mai mult de o duzină de biserici împrăștiate prin zonă. Procesul de aderare la o biserică era riguros, deoarece membrii trebuiau să se adreseze ministrului și să explice convertirea lor. Cu toate acestea, Winthropcredea că majoritatea oamenilor care au făcut călătoria în Lumea Nouă își dovediseră deja dedicarea față de Dumnezeu prin căutarea unui mediu pur.
Credința puritană credea cu tărie în puterea individului și evita ierarhiile unor biserici mai bine stabilite precum Biserica Angliei și Biserica Romano-Catolică.Cu toate acestea, o problemă a acestei credințe era că biserica puritană nu avea o ortodoxie specifică sau control asupra a ceea ce predau bisericile individuale – o supraveghere care a provocat mai multe crize majore pentru noua colonie.
În 1631, George Phillips, pastorul bisericii din Watertown, a început să își învețe congregația că atât Biserica Angliei, cât și Biserica Catolică erau biserici „adevărate” – opusul a ceea ce susținea credința puritană, și anume că ambele erau prea corupte pentru Dumnezeu. Winthrop a călătorit la Watertown pentru a-l dezbate pe pastor în fața congregației. La sfârșitul nopții, toți membrii bisericii, cu excepția a trei, au recunoscut că învățăturile lui Phillips și credințele lor fuseseră eronate.
O criză mai serioasă a implicat un predicator fermecător și binevoitor pe nume Roger Williams. Problema cu formarea unei colonii care să atragă separatiști religioși era că, de multe ori, aceștia nu se temeau să ia atitudine împotriva guvernului și a pozițiilor stabilite ale bisericii, chiar și a unei biserici separatiste cum era însăși biserica puritană.Williams fusese implicat în proiectul Massachusetts Bay încă din primele sale zile, participând chiar la prima întâlnire din 1629. Când Williams a sosit în străinătate la Lyon în mijlocul primei ierni, Winthrop a salutat sosirea „ministrului evlavios”. Apoi, Williams a fost invitat să devină pastor al bisericii din Boston, dar a refuzat, crezând că biserica din Boston era prea impură pentru el, deoarece nu toată lumea din biserică condamna Biserica Anglicană.Winthrop l-a criticat aspru pe Williams, numindu-i opiniile greșiteși lăsând să se înțeleagă că își va folosi autoritatea pentru a împiedica biserica să negocieze pentru a-l obține pe Williams. Williams a plecat la Salem, dar nu înainte de a amenința că autoritatea civilă a lui Winthrop nu poate interveni în problemele bisericii. Biserica din Salem, condusă de John Endecott, l-a primit cu brațele deschise până când, Winthrop i-a scris lui Endecott „minunându-se „că orașul ar accepta un pastor atât de periculos. În cele din urmă, Williams s-a stabilit în Plymouth, în afara sferei de influență a lui Winthrop.Nu avea să fie mulțumit acolo pentru mult timp.
În 1633, guvernatorul din Plymouth, John Bradford, a comentat că Williams începuse să exprime și să practice „opinii ciudate”, ceea ce a dus în cele din urmă la plecarea predicatorului din biserică. Plângerea sa era că, atunci când cetățenii din Plymouth se vor întoarce în Anglia, vor participa la slujbele anglicane, contaminând astfel biserica din Plymouth la întoarcerea lor. Williams s-a întors la Salem, unde oamenii l-au numit asistent al preotului, iar el a pornit imediat să purifice biserica din Salem.
Winthrop și alți lideri coloniali au început să-l interogheze în legătură cu o declarație pe care a făcut-o în Plymouth, care atesta că coloniștii nu aveau dreptul la pământul pe care îl ocupau. Williamsa afirmat că regele guverna printr-o „minciună publică solemnă” și că nu avea dreptul de a acorda pământ coloniei. Curtea Generală a ordonat imediat ca Williams să se prezinte la următoarea ședință pentru a fi cenzurat.Winthrop a încercat să minimalizeze confruntarea și i-a scris lui Williams, indicându-i modalități prin care să își nuanțeze declarațiile făcute în fața curții.Williams s-a comportat satisfăcător pentru curte și nu s-a mai spus nimic despre acest incident.
Cu toate acestea, în noiembrie 1634, la șase luni după ce Winthrop fusese înlăturat din funcția de guvernator, a ajuns la curte vestea că Williams începuse din nou să își reafirme convingerile. El le spunea coloniștilor că carta trebuia să fie rescrisă sau că întreaga colonie va trebui să fie dizolvată pentru a o „purifica”. Când Curtea Generală l-a rechemat pe Williams, miniștrii din zonă au cerut în schimb să-l consilieze pe transgresor în particular – împiedicându-l astfel pe Williams să trimită o scrisoare redactată către rege în care îl acuza de minciună. Din nou și din nou în următorul an, Williams a fost rechemat să apară în fața curții, de fiecare dată după ce încălcase moravurile puritanilor. Pedeapsa nu a avut însă prea mult efect asupra congregației sale, iar în primăvara anului 1635, biserica din Salem l-a numit pastor deplin.
Curtea Generală și alți preoți au reacționat cu fermitate.În timp ce bisericile nu au putut acționa împotriva Salemului pentru a împiedica învățăturile luiWilliams, guvernul civil nu a avut astfel de scrupule.Salem ceruse mai mult teren pe o peninsulă din apropiere, iar Curtea Generală a anunțat că orașul putea obține terenul doar dacă îl îndepărta peWilliams din poziția sa – o mișcare care i-a înfuriat pe locuitorii din Salem. Aceștia au apelat la alte biserici din zonă pentru ajutor, dar apelurile lor au căzut în urechi surde. În timp ce curtea se lupta cu Salem, întreaga colonie s-ar fi putut prăbuși dacă Williams nu ar fi fost reținut în casa sa din cauza unei boli; el nu putea comunica decât prin scrisori și astfel farmecul său s-a pierdut atât pentru Salem, cât și pentru curte. El le-a cerut locuitorilor din Salem să renunțe la toate celelalte biserici și să se declare singura biserică „adevărată” – o mișcare periculoasă și izolatoare. Salemul s-a împotrivit.
Într-o confruntare finală, Curtea Generală l-a chemat pe Williams să se prezinte în octombrie 1635, unde i-a ordonat să părăsească colonia în termen de șase săptămâni. Ulterior, a prelungit termenul până în primăvara următoare,dar în ianuarie 1636 Williams a părăsit Massachusetts Bay cu o bandă de adepți și s-a îndreptat spre Golful Narragansett din Rhode Island din apropiere.
Pentru moment, biserica puritană și setul lor de credințe erau în siguranță. Winthrop a gestionat cu abilitate cea mai mare criză cu care se confrunta noua colonie și a salvat-o încă o dată de la o posibilă ruină.
.