Amniotavdelningen delade sig i de ursprungliga däggdjurs- och reptilavdelningarna för ∼320 miljoner år sedan. I dag är de överlevande medlemmarna av dessa linjer däggdjur, som omfattar ∼4 500 arter, och reptiler, som innehåller ∼17 000 arter. Inom reptilerna skiljde sig de två största kladerna åt för ∼280 miljoner år sedan: lepidosaurierna, som innehåller ödlor (inklusive ormar) och tuatara, och archosaurierna, som innehåller krokodiler och fåglar (sköldpaddornas position är fortfarande oklar)6. För enkelhetens skull kommer vi här att referera till lepidosaurier som ödlor (fig. 1).
Högsta kännetecken för ödleutvecklingen, inklusive homogenisering av GC-innehållet, hög omsättning av könskromosomerna och höga nivåer av upprepade inlagringar presenteras. Uppfinningar av könskromosomerna anges med rött. Förgreningslängden är proportionell mot dS (den synonyma substitutionshastigheten); dS för varje gren anges ovanför linjen.
PowerPoint-slide
Studien av de viktigaste genomiska händelserna som åtföljde övergången till en helt terrestrisk livscykel har underlättats av sekvenseringen av flera däggdjur (K.L.-T. et al., manuskript inlämnat) och tre fågelgenomer2,3,4. Genomet hos ödlan A. carolinensis fyller således en viktig lucka i täckningen av amnioter, vilket delar den långa grenen mellan däggdjur och fåglar och möjliggör en mer robust evolutionär analys av amnioternas genomer.
Nästan alla reptilers genomer innehåller till exempel mikrokromosomer, men dessa har endast studerats på sekvensnivå hos fåglar2,7, vilket ger upphov till frågan om fåglarnas speciella sekvensegenskaper är universella för alla mikrokromosomer hos reptiler.
Det är därför viktigt att ta hänsyn till att fågelns mikrokromosomer är universella för alla reptilers mikrokromosomer8. Ett annat exempel är studiet av könskromosomernas utveckling. Nästan alla däggdjur av placenta och pungdjur har homologa könskromosomer (XY)9 och alla fåglar har ZW-könskromosomer. Ödlor uppvisar dock antingen genetisk eller temperaturberoende könsbestämning10. Karaktärisering av ödlornas könskromosomer skulle göra det möjligt att studera tidigare okända könskromosomer och jämföra oberoende könskromosomsystem hos närbesläktade arter.
Anolis-ödlor utgör en mångsidig klad med ∼400 beskrivna arter som är fördelade över hela Neotropien. Dessa ödlor har strålat ut, ofta konvergent, till en mängd olika ekologiska nischer med åtföljande morfologiska anpassningar, vilket utgör ett av de bästa exemplen på adaptiv strålning. Särskilt deras diversifiering till flera replikationsnischer på olika karibiska öar via interspecifik konkurrens och naturligt urval har dokumenterats i detalj11. A. carolinensis är den enda anole som är infödd i USA och kan hittas från Florida och Texas upp till North Carolina. Vi valde denna art för genomsekvensering eftersom den används i stor utsträckning som reptilmodell för experimentell ekologi, beteende, fysiologi, endokrinologi, epizootik och, i allt större utsträckning, genomik.
Den gröna anolens genom sekvenserades och sammanställdes (AnoCar 2.0) med hjälp av DNA från en honlig ödla från A. carolinensis (kompletterande tabeller 1-4). Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) av 405 kloner av bakteriella artificiella kromosomer (BAC) (från en hane) gjorde det möjligt att förankra sammansättningsställningar till kromosomer (kompletterande tabell 5 och kompletterande figur 1). A. carolinensis-genomet har rapporterats ha en karyotyp med n = 18 kromosomer, bestående av sex par stora makrokromosomer och 12 par små mikrokromosomer12. Utkastet till genomsekvens är 1,78 Gb stort (se kompletterande tabell 3 för statistik över sammansättningen) och utgör ett mellanting mellan genomsammansättningar av fåglar (0,9-1,3 Gb) och däggdjur (2,0-3,6 Gb).
Vi finner att få kromosomala omarrangemang har inträffat under de 280 miljoner år som förflutit sedan anole och kyckling skiljde sig åt, vilket tidigare jämförelser med Xenopus och kyckling13 har gett en antydan om. Det finns 259 synteniska block (definierade som på varandra följande synteniska ankare som är konsekventa i ordning, orientering och avstånd, med en upplösning på 1 Mb) mellan ödla och kyckling (kompletterande tabell 6 och kompletterande figur 2). Intressant nog är 19 av 22 förankrade kycklingkromosomer var och en syntenta till en enda A. carolinensis-kromosom i hela deras längd (fig. 2a). Däremot är endast 6 (av 23) människokromosomer syntenta till en enda opossumkromosom i hela deras längd, trots att arterna skilde sig åt för endast 148 miljoner år sedan14. Segmentala duplikationer följer trender som setts i andra amniota genomer (kompletterande anmärkning, kompletterande tabell 7 och kompletterande figur 3).
a, Mycket få omarrangemang har inträffat under de 280 miljoner år som gått sedan A. carolinensis och kyckling divergerade. A. carolinensis mikrokromosomer är uteslutande synteniska till kycklingens mikrokromosomer. Horisontella färgade staplar visar de sex A. carolinensis-makrokromosomerna (1-6) och de sex (av 12) A. carolinensis-mikrokromosomer som har en sekvens förankrad till sig som är syntenisk med kycklinggenomet (7, 8, 9, X, LGg, LGh). Kromosomer som kunde ordnas efter storlek tilldelades ett nummer; de mindre mikrokromosomer som inte kunde särskiljas efter storlek tilldelades en liten bokstav. Varje färg motsvarar en annan kycklingkromosom som anges i nyckeln. Varje del av en A. carolinensis-kromosom som är syntenisk med en kycklingmikrokromosom anges med ”m”. b, Kycklingmikrokromosomer har både högre GC-innehåll och lägre repetitionsinnehåll än kycklingmakrokromosomer, medan A. carolinensis-kromosomer inte varierar i GC- eller repetitionsinnehåll beroende på kromosomstorlek. Stora cirklar anger GC-procenten för varje kromosom i kyckling- och ödlegenomerna med mer än 100 kb sekvenser förankrade till den. Små cirklar anger hur stor andel av genomet som består av repetitiv sekvens för varje kromosom i kycklingens (blå cirklar) och ödlans (röda cirklar) genom.
PowerPoint-slide
Ungefär 30 % av A. carolinensis genom består av rörliga element, som består av en mycket större variation av aktiva upprepningsfamiljer än vad som ses för fågel-2 eller däggdjursgenom15. De mest aktiva klasserna är långa interspenderade (LINE) element (27 %) och korta interspenderade (SINE) element (16 %)16 (kompletterande tabell 8). Majoriteten av LINE-repetitionerna tillhör fem grupper (L1, L2, CR1, RTE och R4) och verkar vara nyligen införda utifrån deras sekvenslikhet (divergensen varierar från 0,00-0,76 %; ref. 17). Detta står i kontrast till observationer av däggdjursgenom, där endast en enda familj av LINEs – L1 – har dominerat under tiotals miljoner år. DNA-transposonerna omfattar minst 68 familjer som tillhör fem superfamiljer: hAT, Chapaev, Maverick, Tc/Mariner och Helitron18. Liksom retrotransposoner verkar majoriteten av DNA-transposonfamiljerna vara relativt unga i motsats till de extremt få nyligen aktiva DNA-transposoner som hittats i andra amniotgenom (kompletterande tabell 9). Sammantaget har A. carolinensis mobila element ett betydligt högre GC-innehåll (43,5 %, P < 10-20) än genomsnittet för hela genomet på 40,3 %. Förutom mobila element har A. carolinensis en hög täthet (3,5 %) av tandemrepeatörer, med en längd- och frekvensfördelning som liknar den för mänskligt mikrosatellit-DNA15. Vi vet nu att amnioternas genom finns i minst tre typer: däggdjursgenom är berikade på L1-element och har en hög grad av ackumulering av mobila element, fågelgenom är fattiga på upprepningar med mycket liten aktivitet av mobila element, medan ödlegenomet innehåller en extremt stor mångfald av aktiva familjer av mobila element, men har en låg ackumulationshastighet, vilket påminner om profilen för mobila element hos teleostatiska fiskar19.
De flesta reptilgenom innehåller mikrokromosomer, men antalet varierar mellan arterna; A. carolinensis-genomet innehåller 12 par mikrokromosomer12, medan kycklinggenomet innehåller 28 par. Fågelmikrokromosomer har mycket distinkta egenskaper jämfört med fågelmakrokromosomer, t.ex. högre GC- och lägre repetitionsinnehåll2 , medan ödlemikrokromosomer inte uppvisar dessa egenskaper (fig. 2b). Anmärkningsvärt är att all sekvens som är förankrad till mikrokromosomer i A. carolinensis också anpassar sig till mikrokromosomer i kycklinggenomet, och alla utom en mikrokromosom i A. carolinensis är synteniska till endast en enda motsvarande mikrokromosom i kyckling (Fig. 2a). Mikrokromosomer som bevaras mellan A. carolinensis och kyckling kan alltså ha uppstått i reptilförfadern, medan de återstående kycklingmikrokromosomerna kan härröra från fågelstammen. Alternativt kan de återstående mikrokromosomerna från kyckling ha funnits i reptilförfadern men smält samman för att bilda makrokromosomer i ödellinjen.
A. carolinensis’ genom har förvånansvärt liten regional variation av GC-innehållet, betydligt mindre än vad som tidigare har observerats för fåglar och däggdjur; det är det enda kända amniotiska genomet vars nukleotidkomposition är lika homogen som grodans genom5 (kompletterande figurer 4 och 5). Figur 3 illustrerar hur det lokala GC-innehållet är evolutionärt bevarat mellan människans kromosom 14 och kycklingens kromosom 5, men i mycket mindre utsträckning med A. carolinensis kromosom 1. Eftersom alla andra sekvenserade amniota genomer än A. carolinensis innehåller dessa homologa varierande nivåer av GC-innehåll (”isokorer”)20 , är det troligt att den ancestrala amniota GC-heterogeniteten hos amnioter har eroderat mot homogenitet i den här ödlans släktlinje. Det har föreslagits att isokorer med högt GC-innehåll är en följd av högre hastigheter av GC-biased genkonvertering i regioner med högre rekombination2. Den större GC-homogeniteten i anolegenomet kan således återspegla mer enhetliga rekombinationshastigheter, eller också en väsentligt minskad bias mot GC under upplösningen av genomvandlingshändelser i A. carolinensis-linjen (för en diskussion, se ref. 5).
A. carolinensis genom visar endast mycket lokal variation i GC-innehållet, till skillnad från människans och kycklingens genom, som också visar större trender i GC-variation, ibland kallade isokorer. Synteniska regioner av människans kromosom 14, kycklingens kromosom 5 och A. carolinensis kromosom 1 visas. Regionerna för människa och kyckling är inverterade och omorganiserade så att de stämmer överens med A. carolinensis-regionen. Blå linjer visar GC-procenten i fönstren på 20 kb. Den lila linjen anger genomsnittet för genomet. Gröna linjer representerar exempel på synteniska ankare mellan de tre genomerna.
PowerPoint-slide
Både temperaturberoende könsbestämning och genetisk könsbestämning av XY-typ har hittats i Iguania10. Inom släktet Anolis finns det arter med heteromorfa XY-kromosomer (inklusive arter med flera X- och Y-kromosomer) och andra med helt homomorfa kromosomer12. Det är känt att A. carolinensis har genetisk könsbestämning21, men formen på dess könskromosomer (ZW eller XY) har hittills varit okänd på grund av avsaknad av uppenbart heteromorfa kromosomer.
En djupgående undersökning av han- och honceller med hjälp av FISH gjorde det möjligt för oss att identifiera den mikrokromosom som tidigare betecknats som ”b” som A. carolinensis X-kromosom; den finns i två kopior hos honorna och en hos hanarna. Denna kromosom är syntenisk med kycklingens mikrokromosom 15. Elva BAC:er som tilldelats två scaffolds, 154 (3,3 Mb) och chrUn0090 (1,8 Mb), hybridiserar via FISH till p-armarna av de två X-kromosomerna hos honor och hybridiserar till p-armen av den enda X-kromosomen hos hanar (fig. 4 och kompletterande fig. 1). A. carolinensis uppvisar därmed ett mönster som är representativt för ett hanligt heterogametiskt system för genotypisk könsbestämning. Vi har inte identifierat Y-kromosomen, men vi antar att A. carolinensis har både X- och Y-kromosomer, eftersom både han- och honceller innehåller samma antal kromosomer.
a, b, X-kromosomen, en mikrokromosom, finns i ett exemplar hos hanar av A. carolinensis (a) och i två exemplar hos honor (b). BAC 206M13 (CHORI-318 BAC-biblioteket) hybridiseras till X-kromosomens p-arm med hjälp av FISH i både han- och honköns metafasspridningar. 206M13 och tio andra BACs visade detta könsspecifika mönster i celler från fem manliga och fem kvinnliga individer. Original förstoring, ×1 000.
PowerPoint bild
De 5,1 Mb sekvens som tilldelats X-kromosomen innehåller 62 proteinkodande gener (kompletterande tabell 10); Gene Ontology (GO)-termer som är förknippade med dessa gener visar ingen signifikant anrikning. Det är mycket troligt att det finns mer X-kromosomsekvens som för närvarande är märkt som oförankrade scaffolds i AnoCar 2.0-samlingen. Identifiering av A. carolinensis könsbestämningsgen kommer att kräva betydande funktionell biologi, men vi noterar att kycklingens könsbestämningsgen DMRT1 är belägen på A. carolinensis kromosom 2 och att SOX3 (X-kromosomens paralog till könsbestämningsgenen SRY hos däggdjursdjur i terianen) är belägen på en oförankrad A. carolinensis-ställning; det är därför osannolikt att dessa gener är A. carolinensis könsbestämningsgen.
Alla tio A. carolinensis-gener är i A. carolinensis-ställning. carolinensis-individer (med ursprung i South Carolina och Tennessee) som användes för FISH-kartläggning uppvisade stora pericentromeriska inversioner i en eller flera av kromosomerna 1-4, utan någon korrelation mellan olika kromosomala inversioner eller med ödlans kön (se kompletterande anmärkning, kompletterande tabell 11 och kompletterande figur 11). Totalt 17 472 proteinkodande gener och 2 924 RNA-gener förutspåddes från A. carolinensis genomsammansättning (Ensembl release 56, september 2009). Vi byggde en fylogeni för alla A. carolinensis gener och deras homologer i åtta andra ryggradsdjursarter (människa, mus, hund, opossum, platypus, kyckling, zebrafink och puffelfisk), vilket gör det möjligt att identifiera en konservativ uppsättning av 3 994 en-till-en-ortologer, dvs. gener som inte har dubbletterats eller raderats hos något av dessa ryggradsdjur sedan deras sista gemensamma förfader. Dessa genfylogenier användes också för att identifiera gener som uppstod genom duplicering i ödellinjen efter uppdelningen med fågellinjen och, separat, de som försvann i däggdjurslinjen efter uppdelningen mellan däggdjur och reptiler (Fig. 1, Supplementary Note, Supplementary Fig. 7 och kompletterande tabell 12).
Vi hittade 11 opsingener från A. carolinensis som inte har några ortologer från däggdjur (men som har ortologer från ryggradslösa djur, fiskar och grodor), och som därför verkar ha gått förlorade under däggdjurens evolution (kompletterande tabell 13). Den stora repertoaren av opsins kan bidra till anolernas utmärkta färgseende – inklusive förmågan att se i det ultravioletta området – och kan också bidra till deras hyperdiversitet genom att möjliggöra evolutionen av olika, artspecifika färgsättningar av dammluckan, som har en viktig roll i det sexuella urvalet och artkännedomen11. På samma sätt är luktreceptor- och β-keratingener starkt duplicerade hos A. carolinensis (kompletterande anmärkning och kompletterande figur 9).
Många reptiler, inklusive gröna anoler, skiljer sig från placentala däggdjur genom att de är oviparösa (lägger ägg). Viviparitet hos placentala däggdjur är ett härlett tillstånd, vilket återspeglas i deras förlust av vissa äggrelaterade gener. Vi använde masspektrometri för att identifiera proteiner som finns i det omogna ägget från A. carolinensis, eftersom de flesta äggproteiner produceras i moderns kropp och sedan transporteras in i det omogna ägget. Vi fann att i motsats till däggdjur har reptiler linjespecifika genduplikationer, bland annat i vitellogeniner (VTG), apovitellenin-1, ovomucin-α och tre homologer av ovocalyxin-36, ett matrisprotein från kycklingäggskalet.
Våra resultat visar på en snabb evolution av äggproteingener bland amnioter. Specifikt fann vi proteiner från 276 A. carolinensis-gener i omogna A. carolinensis-ägg (kompletterande tabeller 14 och 15), av vilka endast 50 har bekräftats finnas i kycklingägg genom masspektrometri22,23. Dessa gener omfattar VTGs, ett lysozym, paraloger till vitellinmembranens yttre skiktprotein 1 (VMO1), proteashämmare, natterin och nothepsin. Genom att anpassa gener som är en-till-en ortologer i A. carolinensis och kyckling fann vi att äggproteiner utvecklas betydligt snabbare än icke-äggproteiner (genomsnittliga dN/dS-värden (förhållandet mellan hastigheten för icke-synonyma substitutioner och hastigheten för synonyma substitutioner) på 0,186 respektive 0,135; P = 1.2 × 10-5), vilket återspeglar minskat renande urval och/eller mer frekventa episoder av adaptiv evolution.
Med hjälp av flera ryggradsdjursgenomsekvenser identifierade vi tre VMO1-paraloger (som vi benämner α, β och γ) som vi drar slutsatsen att de har funnits i den sista gemensamma förfadern till alla reptiler och däggdjur. Medan minst en av VMO1-α, VMO1-β och VMO1-γ har gått förlorad i alla andra amniota genomer, innehåller A. carolinensis genom representanter för alla tre paraloger. Dessutom har den A. carolinensis-specifika VMO1-α-familjen vuxit till 13 medlemmar och har genomgått en positiv selektion av aminosyrasubstitutioner inom en negativt laddad, troligen substratbindande kavitet; förändringar som förmodligen ändrar dess lysozymliknande transferasaktivitet (kompletterande anmärkning, kompletterande figur 8 och kompletterande tabeller 16 och 17).
Den omfattande och aktiva upprepningsrepertoaren hos A. carolinensis har gjort det möjligt för oss att upptäcka ursprunget till flera konserverade element hos däggdjur. Genom exaptationsprocessen (en större förändring av en sekvens funktion under evolutionen) har vissa rörliga element som var aktiva hos amnioternas förfäder blivit konserverade och förmodligen funktionella hos däggdjuren, samtidigt som de förblir aktiva rörliga element hos A. carolinensis. Ursprunget till dessa bevarade däggdjurssekvenser i mobila element kunde inte kännas igen utan jämförelse med en avlägsen och upprepningsrik genomsekvens24. Vi identifierade 96 sådana exapterade element (se kompletterande tabell 18) i det mänskliga genomet som går tillbaka till mobila element som fanns i amnioternas förfäder och som fortfarande finns kvar i A. carolinensis, särskilt CR1-, L2- och gypsy-familjerna.
Och även om de flesta exapterade element är icke-kodande och förmodligen har en reglerande funktion, identifierade vi också en proteinkodande exon som exapterades från en L2-liknande LINE och som nu utgör exon 2 i en däggdjursspecifik N-terminal region av MIER1-proteinet (mesoderm induction early response 1). Detta exon är starkt konserverat hos 29 däggdjur och representerar därför troligen en däggdjursinnovation sedan amniotens förfader.
GO-termer som är associerade med transkriptionens startplats närmast varje exapterat element i det mänskliga genomet visar på en anrikning för neuroutvecklingsgener (se metoder), med ”ephrinreceptorbindning”, ”nervsystemets utveckling” och ”synaptisk överföring” som är starkt anrikade (alla P-värden < 5 × 10-3). Dessa berikningar stämmer överens med adaptiva förändringar i neuroutvecklingen under däggdjurens uppkomst.
Anolis-ödlor är ett typexempel på adaptiv strålning, eftersom de har diversifierats oberoende av varandra på varje ö i de stora Antillerna och i hela Neotropien, vilket har gett upphov till ett stort antal ekologiskt och morfologiskt differentierade arter, med så många som 15 arter på en enda lokalitet11. Även om anoler i stor utsträckning används som ett modellsystem för fylogenetiska jämförande studier har det varit svårt att fastställa de evolutionära relationerna mellan större anolklasser på grund av snabba evolutionära radiationer i samband med tillgång till nya dimensioner av ekologiska möjligheter. För att lyckas lösa de relativt korta förgreningshändelser som är förknippade med en sådan strålning krävs en mängd data från loci som utvecklas i lämplig takt.
Vi använde genomsekvensen av A. carolinensis för att utveckla en ny fylogenomisk datamängd som består av 20 kb sekvensdata som samplats från genomet hos 93 arter av anoler (kompletterande tabeller 19 och 20). Analyser av denna datamängd leder till en väl underbyggd fylogeni som förstärker och förtydligar anolernas adaptiva och biogeografiska historia (fig. 5, detaljer i kompletterande fig. 10). För det första bekräftar vår fylogenomiska analys tidigare molekylära och morfologiska studier som visar att liknande livsmiljöspecialister för anoler har utvecklats oberoende av varandra på var och en av de fyra stora öarna i Stora Antillerna. För det andra tyder våra analyser på ett komplext biogeografiskt scenario med ett begränsat antal spridningshändelser mellan öarna och en omfattande diversifiering på plats inom öarna. De närmaste släktingarna till Anolis förekommer på fastlandet och fylogenin bekräftar förekomsten av två kolonisationer, en till de södra små Antillerna och den andra som gav upphov till de olika adaptiva radiationerna i resten av Karibien. Inom den sistnämnda kladen diversifierades anolerna ursprungligen främst på de två större öarna i Stora Antillerna (även om Puerto Rico också verkar ha varit inblandat) innan de senare genomgick sekundära utstrålningar på alla öarna och slutligen återvände till fastlandet, där denna återkolonisering har gett upphov till en omfattande evolutionär strålning. Fylogenin visar också att mycket få spridningshändelser mellan öarna har inträffat under de stora antilleanernas utveckling. Snarare är faunan på de stora Antillerna, som är känd för att samma ekomorfer finns på varje ö, i första hand ett resultat av konvergent evolution25.
Anolis ekomorfer härrör från konvergent evolution och inte från frekventa migrationer mellan öar. Med hjälp av bevarade primerpar som är fördelade över genomet hos A. carolinensis erhåller vi sekvenser från 46 genomiskt olika loci som utvecklas med olika evolutionära hastigheter och som representerar både proteinkodande och icke-kodande regioner. Maximal sannolikhetsanalyser av denna nya datamängd av 20 kb avstämda nukleotider leder till nästan alla tidigare etablerade släktskap mellan anoler, samtidigt som de delvis löser de basala släktskap som har försvårat tidigare studier. Öppna cirklar anger bootstrap (bs)-värden <70; gråskuggade cirklar, 70< bs <95; fyllda cirklar, bs >95.
PowerPoint-slide
Genomsekvensen av A. carolinensis möjliggör en djupare förståelse av amnioternas evolution. Att fylla denna viktiga reptilknutpunkt med ett sekvenserat genom har avslöjat härledda tillstånd i varje större amniotgren och har bidragit till att belysa amnioternas anfader. Trädet med sekvenserade reptilgenom är dock fortfarande extremt sparsamt, och sekvensering av ytterligare icke-aviära reptiler skulle vara nödvändig för att fullt ut förstå hur typiska A. carolinensis och de sekvenserade fågelgenomerna är för hela reptilkladen.
Förutom användbarheten av A. carolinensis genomsekvens som representant för icke-aviära reptiler, är Anolis-arter en unik resurs för studiet av adaptiv strålning och konvergent evolution. Med sina invasioner av och efterföljande radiationer på karibiska öar utgör anolerna en terrestrisk analogi till pigghaj och ciklidfiskar, som genomgick en adaptiv evolution i separata vattenmiljöer. På samma sätt som genomisk forskning om sticklebacks har fördjupat studiet av ekologisk artbildning i vattenmiljön, skulle en storskalig genomisk fylogenetisk undersökning av de karibiska anolerna ge möjlighet till en detaljerad studie av adaptiv evolution hos ett landlevande djur26 , i synnerhet eftersom anolernas genomer innehåller ett stort antal aktiva rörliga element som vi spekulerar i skulle kunna utgöra substrat för exaptering av nya reglerande element.