B. B-cellsepitoper
Vi begränsar vår diskussion till B-cellsepitoper på proteiner och peptider; epitoper på andra biopolymerer och hapteniska grupper omfattas inte. Den första viktiga generaliseringen om B-cellsepitoper är att de är riktade mot tredimensionella egenskaper på den molekylära ytan hos proteiner och polypeptider. En särskild tredimensionell topologi är ett kännetecken för B-cellsepitoper till skillnad från T-cellsepitoper. Det är troligt att alla aminosyrarester som är tillgängliga från ett proteins yta kan ingå i en eller annan B-cellsepitop (Benjamin et al., 1984). Proteiner kan därför innehålla väldigt många olika epitoper även om endast ett begränsat antal antikroppar av steriska skäl kan binda till antigenet samtidigt. B-cellssvaret är stereospecifikt och är mycket svagare mot d-enantiomerer av peptider (Gill et al., 1963) och proteiner (Dintzis et al., 1993), möjligen på grund av att d-enantiomerer av proteiner inte bearbetas effektivt för att ge peptider för T-cellshjälp.
Förr trodde man att proteiner hade en väldefinierad antigenisk struktur som kännetecknades av ett begränsat antal epitoper. Insikter om den komplexa karaktären hos B-cellernas immunsvar och dess reglering samt om de monoklonala antikropparnas specificitet mot proteiner gjorde det tydligt att ett protein inte har en definierad antigenisk struktur. Det är inte möjligt att definiera ett proteins ”fullständiga antigena struktur”, i motsats till vad vissa forskare hävdar (Atassi och Lee, 1978; Atassi, 1984). Ett proteins antigenicitet är både en egenskap hos proteintopografin och hos värdens immunsystemets regleringsmekanismer, inklusive tolerans mot strukturer som liknar värdets egna proteiner, T-cellshjälpens specificitet och idiotypa nätverk (Benjamin et al., 1984; Berzofsky, 1985). Immunodominanta platser, dvs. platser som de flesta men inte alla antikroppar i immunsvaret är riktade mot, är inte en inneboende egenskap per se hos proteinet. Som andra tidigare påpekat existerar epitoper inte i sig själva utan endast i kraft av en förbindelse med den komplementära antikroppsbindningsstället, den så kallade paratopen (Berzofsky, 1985; Van Regenmortel, 1986, 1989). Därför är en epitop ett relationellt begrepp, och definitionen av en epitop är nödvändigtvis operativ (Van Regenmortel, 1986). Med andra ord beror definitionen av en viss epitop i stor utsträckning på den molekylära geometrin och den kemiska karaktären hos motsvarande paratop och, kanske ännu viktigare, på det experimentella tillvägagångssätt som valts för att kartlägga epitopen.
Detta sakförhållande kan illustreras av exemplet med det första protein-antikroppskomplex vars struktur löstes med hjälp av röntgenkristallografi (Amit et al., 1986). I detta komplex kontaktar 16 lysozymrester 17 rester av ett monoklonalt Fab-fragment (antikroppsfragment) mot lysozym. Epitopen sträcker sig över 750 Å2 av lysozymets yta. Epitopkartläggning med en serie sekvensrelaterade aviära lysozymämnen visar däremot att endast några få rester är viktiga för bindningen av lysozym till monoklonala antikroppar mot lysozym. Mutation av mycket få rester kan radikalt minska associationskonstanten för lysozym-antikroppskomplexet (Harper et al., 1987). I ett fall minskade ett enda byte mellan Arg och Lys lysozymets affinitet för en monoklonal antikropp med två storleksordningar (Smith-Gill et al., 1982). Teoretiska beräkningar baserade på kristallstrukturer av två komplex av lysozym med Fab-fragment visade att av de många rester som definierar epitopen i kristallen är det bara några få som faktiskt bidrar till komplexets stabilitet (Novotny et al., 1989). På grundval av sina beräkningar skiljer Novotny et al. mellan en energisk epitop och en passiv epitop. Den energetiska epitopen omfattar de rester som bidrar till den energetiska bindningen. Den passiva epitopen ger endast ytkomplementaritet runt de rester som bildar den energetiska epitopen. Att endast ett fåtal av de interaktioner som syns i kristallstrukturen spelar en viktig roll för att stabilisera antigen-antikroppskomplexet bekräftades för bindning av neuraminidas av influensavirus till en monoklonal antikropp. Nitton rester av neuraminidaset kontaktar 17 rester av antikroppen i kristallen, men platsspecifik mutation av endast tre rester upphäver helt bindningen (Air et al., 1990; Nuss et al., 1993).
En mer allmänt tillämplig operativ distinktion av epitoper är den mellan en kontaktepitop och en funktionell epitop. Den funktionella epitopen avser information som erhålls från den tredimensionella strukturen hos antigen-antikroppskomplexet, medan den funktionella epitopen avser information från icke-kristallografiska kartläggningsförfaranden, inklusive epitopkartläggning med peptider. En kontaktepitop representeras av en matchning mellan stora komplementära ytor hos antigen och antikropp, vilket ses i flera röntgenstrukturer av protein-antikroppskomplex (Davies och Padlan, 1990; Wilson och Stanfield, 1994; Braden och Poljak, 1995). Kontaktpitoper täcker flera hundra kvadratangström av den molekylära ytan. Den funktionella epitopen definierar rester som verkar viktiga för antikroppsbindning och vars mutation kan minska eller helt upphäva bindningen. Den funktionella epitopen kan bestå av så få som 2-3 rester, som i exemplen lysozym och neuraminidas som nämns ovan. Det är inte möjligt att härleda kontaktepitopen från den funktionella epitopen. På samma sätt avslöjar kontaktepitopen inte i sig själv den funktionella epitopen. När det gäller antikroppen kan man också skilja mellan två typer av paratoper: en funktionell paratop och en kontaktparatop. Detta följer av termodynamisk analys av de komplementaritetsbestämmande regionerna hos en monoklonal antikropp (Kelley och O’Connell, 1993).
Den dubbla karaktären hos en epitop som avslöjas av kristallografiska och icke-kristallografiska kartläggningstekniker återspeglar två olika modeller för molekylärt erkännande. Sett på detta sätt förskjuts svårigheten att definiera epitopernas natur till nivån för en epistemologisk svårighet: hur ska vi modellera verkligheten med hjälp av de begränsade experimentella medel som står till vårt förfogande? Vi kommer att ha dessa begränsningar i åtanke när vi diskuterar epitopkartläggning med hjälp av peptider.
Här måste vi nämna den sedan länge kända begreppsklassificeringen av B-cells epitoper i sekventiella och konformationella (Sela et al., 1967; Sela, 1969; Atassi och Smith, 1978). En epitop kallas sekventiell eller kontinuerlig om den kan representeras av en serie sammanhängande rester av en polypeptidkedja. En antikropp sägs känna igen en sekventiell epitop om den reagerar med en kort, flexibel peptid eller med den denaturerade, oveckade polypeptidkedjan. En konformationell epitop, även kallad diskontinuerlig, topografisk eller sammansatt, byggs upp av icke sammanhängande delar av aminosyrasekvensen genom veckning av polypeptidkedjan i det ursprungliga proteinet. En antikropp sägs känna igen en konformationsepitop om den reagerar med ett nativt protein och inte med den utvikta polypeptidkedjan, eller om den reagerar med en peptid med unik konformation, t.ex. en helix, men inte med en slumpmässig spiralpeptid.
Skillnaden mellan sekventiella och konformationella epitoper är något godtycklig och kan vara vilseledande. Eftersom varje paratop har en väldefinierad tredimensionell struktur är interaktionen mellan paratop och epitop alltid en anpassning av strukturer i det tredimensionella rummet. Detta gäller för en epitop på ett välordnat globulärt protein såväl som för en epitop på en kort flexibel peptid. I det senare fallet måste peptiden också anta en unik konformation när den binder till antikroppen; därför är en kontinuerlig epitop också ”konformativ”. Bindningskonformationen finns antingen redan i förväg eller induceras av paratopen (se avsnitt V,B och V,C).
I fallet med antikroppar mot nativa proteiner har det hävdats att de flesta eller kanske alla epitoper är diskontinuerliga (Barlow et al., 1986). På grund av den stora storleken på en typisk kontaktepitop i en antigen-antikroppskristall är det i själva verket osannolikt att en antikropp binder uteslutande till en sammanhängande sträcka av polypeptidkedjan och inte också till kontaktrester som är åtskilda i sekvens men nära i rummet. Rymdfyllnadsmodeller av proteiner visar få linjära sträckor som är längre än 4-5 rester i direkt peptidlänkning som är tillgängliga på molekylens yta. Detta betyder inte att en antikropp riktad mot en sammansatt epitop på ytan av ett protein inte kan korsreagera även med en peptid som motsvarar ett segment av proteinet.
Som avslutning på vår översikt över karaktären hos B-cellsepitoper understryker vi än en gång den stora svårigheten att ge en allmän definition av ”epitop”. En pragmatisk användning av operativa definitioner kanske inte behagar puristen, men operativa definitioner kan vara till hjälp när det gäller att besvara frågor om karaktären hos en viss interaktion mellan antigen och antikropp.