Tetracyklininducerbara system har använts i stor utsträckning i jäst för att studera kontrollen av gentranskriptionen i enskilda celler15,16,17,18,19,20,21,22. För att använda rtTA i detta sammanhang skapade vi två starka doxycyklinresponsiva promotorer med antingen tre (PTET3) eller fyra (PTET4) rtTA-bindningsställen och använde den optimerade rtTA-M2-varianten7 för att kontrollera uttrycket av yeast-förstärkt grönt fluorescerande protein (yeGFP)23 från dessa promotorer (fig. 1a). Expressionskassetten rtTA/PTET-yeGFP integrerades i en enda kopia i jästgenomet. M2-varianten är identisk med den variant som finns i ClonTechs Tet-ON Advanced-expressionssystem.
rtTA-M2 har en signifikant aktivitet utan doxycyklininduktion.
(a) Schematisk bild av försöksuppställningen där rtTA-M2 uttrycks från de konstitutiva promotorerna PMYO2 eller PTDH3 och yeGFP uttrycks från en tet-responsiv promotor. (b) Doxycyklin-dosberoende aktivering av rtTA-M2 uttryckt från antingen PMYO2 eller PTDH3 (medelvärde +/- s.e.m. av tre tekniska replikat). AutoFL är jästceller av vildtyp BY4742. (c) Fördelningar av fluorescens från enskilda celler som erhållits från celler som bär PMYO2-rtTA-systemet vid olika doxycyklinkoncentrationer. Progressivt mörkare gråtoner motsvarar 0,25, 1, 5 och 100 μg/mL doxycyklin respektive. AutoFL är jästceller av vildtyp BY4742. (d) Sammanslagna ljusfält-fluorescensbilder av jästceller av vildtyp BY4742 eller oinducerade celler som bär på PMYO2-rtTA-systemet.
Problemet med läckage i transkriptionen av målgenerna är särskilt stort när rtTA uttrycks på höga nivåer. Detta illustreras i figur 1b som visar PTET3 doxycyklin dosresponskurvor när rtTA-M2 uttrycks från den starka PTDH3-promotorn. Fluorescensen var mycket hög när cellerna utsattes för mättande mängder doxycyklin. På grund av läckande transkription från PTET3-promotorn var dock systemets dynamiska område ganska dåligt med ett maximalt uttryck som var ~17 gånger större vid full induktion jämfört med frånvaro av doxycyklin.
Sammanhängande med en modell där transaktivatorn har en betydande aktiveringspotential i sitt icke-inducerade tillstånd, minskade uttrycket av rtTA-M2 från den svaga PMYO2-promotorn väsentligt fluorescensen i frånvaro av doxycyklin. Även om full mättnad inte observerades med detta system resulterade minskningen av läckande uttryck i en drastisk förbättring av det dynamiska området och induktion med doxycyklin resulterade i en ~200-faldig ökning av fluorescensen. Trots denna förbättring visade dock både flödescytometridata (fig. 1c) och fluorescensmikroskopidata (fig. 1d) att oinducerad rtTA-M2 orsakar betydande reportergenuttryck även när transaktivatorn uttrycks från en svag promotor.
Under den inledande testningen av tolv kloner som bar PTDH3-rtTA-M2-systemet upptäckte vi genom en slump att en av dem avgav oväntat låg fluorescens i avsaknad av doxycyklin men nästan normal fluorescens vid full induktion (fig. 2a). Efterföljande sekvensering identifierade en enkel nukleotidmutation, guanin till tymin, som ändrar ett glycin (GGG) till ett valin (GTG) vid rest 72 i transaktivatorproteinet. Western blot-analys visade att denna substitution inte påverkar proteinmängden (Fig. 2a, Insert, se Supplementary Fig. S1 för detaljer) och rekonstruktion av uttryckssystemet bekräftade att den enskilda guanin-till-timin-mutationen är ansvarig för de förändringar som ses i doxycyklin-dosresponsen (data inte visad).
Mutation av glycin 72 i rtTA-M2 minskar den basala aktiviteten till odetekterbara nivåer.
(a) Doxycyklin-dosberoende aktivering av rtTA-M2-varianter uttryckt från PTDH3 (medelvärde +/- s.e.m. av tre tekniska replikat). AutoFL är jästceller av vildtyp BY4742. I insatsen, ett western blot (beskuren) som jämför proteinmängden av både rtTA-M2 och G72V-mutanten. Alla prover har förberetts och körts under identiska experimentella förhållanden. (b) Fördelningar av fluorescens från enskilda celler som erhållits från celler som bär PTDH3-rtTA(G72V)-systemet vid olika doxycyklinkoncentrationer. AutoFL är jästceller av vildtyp BY4742. Progressivt mörkare gråtoner motsvarar 1, 2,5, 5 och 100 μg/mL doxycyklin respektive. (c) Sammanfogade ljusfält-fluorescensbilder av oinducerade celler som bär PTDH3-rtTA-M2- eller PTDH3-rtTA(G72V)-systemen. (d) Tecknad representation av TetR-dimer där varje protomer är färgad på olika sätt (gul och turkos). Sekundärstrukturen är märkt och G72 visas som en sfär.
PTPDH3-rtTA-M2(G72V)-systemet har ett anmärkningsvärt dynamiskt omfång och visade en ~500-faldig ökning av fluorescensintensiteten när cellerna inducerades med hög doxycyklin jämfört med ingen induktion (fig. 2b). Dessutom kan fluorescensutsläppet som detekteras med flödescytometri inte särskiljas från cellulär autofluorescens i frånvaro av doxycyklin och varianten bevarar det graderade induktionssvaret hos den ursprungliga transaktivatorn. Dessutom var reporteruttrycket från den oinducerade rtTA-M2(G72V)-stammen odetekterbar med fluorescensmikroskopi även under instrumentinställningar där den oinducerade rtTA-M2-stammen gav en stark mättnadssignal (fig. 2c).
För att få en inblick i hur den enda mutationen kan ha en sådan drastisk påverkan på dynamikomfånget hos rtTA-M2(G72V) undersökte vi var residuet var lokaliserad i kontexten av den tredimensionella strukturen hos proteinet. Strukturen för rtTA-M2 eller andra rtTA-varianter har inte lösts. Eftersom 203 av 207 aminosyror i rtTA:s TetR-domän är bevarade7 ger den högupplösta strukturen av TetR24 dock en inblick i strukturen av rtTA:s DNA-bindningsdomän. I TetR-strukturen kartläggs glycinrest 72 till en flexibel slinga som ligger mellan α-helices α4 och α5, en region som överbryggar repressorns DNA-bindningsdomän (α1-α3) och dess tetracyklinbindningsregion (α5-α9)24,25 (fig. 2d). Detta tyder på att substitutionen, som introducerar en opolär sidokedja, utlöser konformationsförändringar på långa avstånd som i slutändan påverkar transaktivatorns aktivitet, förmodligen genom att stelna dess tertiärstruktur.
För att undersöka denna hypotes skapade vi ytterligare två varianter där glycinresterna muterades till alanin eller prolin. Dessa mutationer bevarar valinresidensens opolära natur men introducerar sidokedjor av varierande storlek. Vi förväntade oss att alanins enkla metylsidokedja skulle vara mindre effektiv när det gäller att förhindra oinducerad aktivitet än prolinets stora cykliska sidokedja. Vi skapade också ett β-östradiol-inducerbart uttryckssystem26 för att få direkt kontroll över rtTA-M2-uttrycket och använde promotorn med en extra TetR-bindningsplats, PTET4, för att öka rtTA:s förmåga att binda DNA. Expressionssystemet illustreras schematiskt i (fig. 3a). Vi bekräftade genom western blot-analys att de fyra rtTA-varianterna uttrycks på liknande nivåer vid full β-östradiol-induktion (fig. 3b, se kompletterande fig. S2 för detaljer) och att fluorescensen hos en stam som saknar rtTA har ett reporteruttryck som inte går att skilja från en jäststam av vildtyp BY4742, vilket visar att det inte finns något bakgrundsreporteruttryck från PTET4 (kompletterande fig. S3).
Non-polära sidokedjor vid rest 72 är en viktig faktor som bestämmer basal aktivitet.
(a) Schematisk bild av gennätverket där rtTA-M2-varianter uttrycks från en β-östradiol-inducerbar promotor och yeGFP uttrycks från en tet-responsiv promotor. (b) Western blot (beskuren) som jämför proteinmängd av alla fyra rtTA-varianter när de induceras av 1000 nM β-estradiol eller ingen induktion. Alla prover framställdes och kördes under identiska experimentella förhållanden. (c) Sammanfogade ljusfält-fluorescensbilder av alla fyra rtTA-varianter inducerade av 1000 nM β-estradiol utan doxycyklininduktion. (d) Den basala aktiviteten hos rtTA-varianterna som en funktion av deras β-östradiolberoende uttrycksnivå (medelvärde +/- s.e.m. av tre tekniska replikat). I insatsen, histogram av reporteruttryck för de olika rtTA-varianterna. (e) Doxycyklin-dosberoende aktivering av rtTA-M2-varianter som uttrycks ubiquitärt i 1000 nM β-estradiol (medelvärde +/- s.e.m. av tre tekniska replikat).
Som väntat visade alaninvarianten ett högre läckageuttryck än valinvarianten och prolinvarianten hade en fluorescens som inte gick att skilja från cellulär autofluorescens mätt med flödescytometri. Detta framgår av fluorescensmikroskopiska bilder som erhållits med instrumentinställningar där stammen som hyser den ursprungliga M2-varianten ger en stark fluorescenssignal vid full β-östradiolinduktion (fig. 3c) och av fluorescensmätningar med flödescytometri vid varierande β-östradiolinduktion (fig. 3d).
Märkligt nog har de aminosyrasubstitutioner som signifikant minskar det basala reportergenuttrycket minimal effekt på rtTA:s transkriptionsaktivering vid full β-östradiol- och doxycyklininduktion. Detta illustreras i figur 3E, som visar dosresponskurvorna för de fyra G72-M2-varianterna som mäts när doxycyklin varieras vid full β-estradiolinduktion. Aminosyrasubstitutionerna påverkar dock doxycyklinkänsligheten. I våra experiment (fig. 3e) hade M2-varianten den högsta känsligheten med en halv maximal effektiv koncentration (EC50) på ~0,06 μg/mL medan alaninvarianten (EC50 på ~0,2 μg/mL), valinvarianten (EC50 på ~1,0 μg/mL) och prolinvarianten (EC50 på ~1.5 μg/mL) krävde successivt högre doxycyklinkoncentrationer för att nå maximal uttrycksförmåga.
För att motverka effekten av G72-mutationen på doxycyklinkänsligheten införde vi ytterligare mutationer i TetR-domänen som nyligen visats öka känsligheten för doxycyklin10,11,27. Vi undersökte särskilt effekten av att införa de känslighetshöjande (SE) mutationerna V9I, F67S, F86Y och R171K.
Figur 4A,B visar att SE-mutationerna förbättrar doxycyklin-känsligheten hos SE-G72P- och SE-G72A-rtTA M2-varianterna. När rtTA-varianterna uttrycks på höga nivåer från den fullt aktiverade β-östradiolinducerbara promotorn (fig. 3a) minskar införandet av SE-mutationerna doxycyklin EC50 från ~1,5 μg/mL till ~0,1 μg/mL för G72P-varianten (fig. 4a) och från ~0,2 μg/mL till ~0,02 μg/mL för G72A-varianten (fig. 4b). Denna effekt inträffade utan en märkbar förändring av reporteruttrycket under full doxycyklininduktion och äventyrade inte det dynamiska området för SE-G72P-varianten. Intressant nog orsakade dock SE-mutationerna en betydande förlust av dynamiskt intervall för SE-G72A-varianten genom att öka reportergenuttrycket i frånvaro av doxycyklin.
Doxycyklin-känsligheten hos de nya rtTA-varianterna kan förbättras genom tillsats av känslighetshöjande mutationer.
(a,b) Doxycyklin-dosberoende aktivering av rtTA-varianter som uttrycks ubiquitärt i 1000 nM β-estradiol (medelvärde +/- s.e.m. av tre tekniska replikat). (c-f) Värmekartor som visar reporteruttryck (Arbitrala enheter) som en funktion av β-östradiolberoende transaktivatoruttryck och doxycyklininduktion.
För att ytterligare utforska sambandet mellan nivån på rtTA-uttrycket, doxycyklin EC50 och basal aktivitet undersökte vi effekten på reportergenuttrycket av att samtidigt variera β-östradiol- och doxycyklininduktion. Vi undersökte fyra olika M2-varianter; originalvarianten, orginalvarianten med SE-mutationerna, G72P-varianten och SE-G72P-varianten.
Den tvådimensionella dos-responsytan för den ursprungliga M2-varianten innehåller tre distinkta regioner av reporteruttryck som motsvarar lågt, mellanliggande och högt reportergenuttryck. Dessa regioner är märkta med I, II och III i figur 4c-f. I region III är reporteruttrycket maximalt, vilket beror på både rtTA-uttrycksnivån och doxycyklininduktionsnivån. Region II är den region där reporteruttrycket är relativt högt även när doxycyklininduktionen är låg. Region I är där reporteruttrycket är lågt på grund av lågt β-östradiol eller låg doxycyklininduktion.
Enbart SE-mutationerna (fig. 4d) ökar dramatiskt reporteruttrycket i en del av region I och hela region II. Detta bekräftar att dessa mutationer kan öka känsligheten i ett smalt intervall av rtTA-uttrycksnivåer, men också orsaka en betydande ökning av aktiviteten hos rtTA i icke-inducerat tillstånd. Som kontrast till detta minskar enbart G72P-mutationen (fig. 4e) dramatiskt reporteruttrycket i hela region II och i en del av region III. Detta bekräftar att den djupgående effekten av denna mutation på rtTA-aktiviteten i det icke-inducerade tillståndet är förknippad med en allmän förlust av doxycyklin-känslighet.
Figur 4f visar effekten av att kombinera SE- och G72P-mutationerna. Jämfört med SE-varianten (fig. 4d) motverkar tillägget av G72P-mutationen den ökning av reporteruttrycket som orsakas av SE-mutationerna i region I och minskar reporteruttrycket till odetekterbara nivåer i denna region. Jämfört med G72P-varianten (fig. 4e) återställer tillägget av SE-mutationerna dessutom nästan helt förlusten av reporteruttryck i region III. Med andra ord förbättras känsligheten utan att införa läckande målgenuttryck på någon transaktivatoruttrycksnivå.