Kromosomanalyser och CMA är kliniskt användbara diagnostiska verktyg för att upptäcka kromosomala avvikelser i hela det mänskliga genomet. För närvarande rekommenderas CMA som det första testet för intellektuell funktionsnedsättning och medfödda defekter, vilket ersätter den tidigare rollen för kromosomanalys. I den här studien jämförde vi resultaten av kromosomanalys och CMA i 3 710 fall för att fastställa värdet av att utföra kromosomanalys.
Maximal upptäckt av mosaikism genom en kombination av CMA och traditionell cytogenetisk analys
Denna studie visade att 1,2 % (43/3 710) av patienterna hade ett mosaikfynd. Mosaikism observerades endast genom kromosomanalys i 39 % av fallen på grund av antingen en mycket låg (<10 %) eller mycket hög (>80 %) procentandel onormala celler medan 12 % av fallen upptäcktes endast genom CMA. De återstående 49 % av fallen upptäcktes genom både CMA och kromosomanalys.
Detekteringen av mosaikism genom CMA och den genom kromosomanalys skiljer sig åt på grund av skillnaden i teknik och analyserad cellpopulation. CMA analyserar DNA som extraherats från alla cellkärnor i perifert blod inklusive flera cellinjer. Kromosomanalys utförs däremot främst på T-lymfocyter som stimuleras av fytohemagglutinin. Studier har visat att CMA kan vara känsligare när onormala celler inte reagerar på mitogener och/eller när avvikelser är sällsynta eller saknas i T-celler, t.ex. vid Pallister-Killians syndrom.5,6 Fem fall av mosaisk trisomi, som involverade kromosomerna 8, 9, 14 och 22, upptäcktes endast med CMA.
Och även om CMA lätt kan upptäcka mosaikism vid nivåer på 30 % eller mer, är det begränsat när det gäller att rutinmässigt upptäcka mosaikism vid nivåer på <10 %.6,13,14 Andra array-plattformar, t.ex. arrayer för enkelnukleotidspolymorfism, kan vara bättre lämpade för att upptäcka mosaikism genom den information som erhålls från B-allelfrekvenserna15,16 . Kromosomanalys kan upptäcka mosaikism på låg nivå genom individuell undersökning av ett stort antal celler. Standardkromosomstudier av 20 celler utesluter 14 % mosaikism på 95 % konfidensnivå. Fler celler kan undersökas när en eller två onormala metafasceller identifieras. Analysen av många enskilda celler är dock tids- och arbetskrävande. Om mosaikism misstänks eller bekräftas kan FISH användas för att undersöka hundratals enskilda interfasceller för att fastställa nivån av mosaikism; FISH är relativt sett mindre tidskrävande än kromosomanalyser.
De abnormiteter som missats av CMA, med undantag för de till synes balanserade omarrangemangen, står för <0,2 % av det totala antalet fall i den här studien ( tabell 2 ). De flesta fall var omöjliga att upptäcka med CMA eftersom andelen onormala celler låg under CMA:s detektionsgräns (<10 %). Den kliniska betydelsen är oklar för den mycket låga nivån av mosaikism i fall 2 och 3, och den lilla markeringskromosomen som uteslutande innehåller pericentromeriska upprepningssekvenser i fall 4. De återstående avvikelser som missas av CMA är förknippade med fenotypiska avvikelser. Det är oklart varför den abnormitet som sågs i 30 % av de odlade cellerna i fall 5 missades av CMA, men det beror förmodligen på att de onormala cellerna är överrepresenterade specifikt i T-cellerna. Närvaron av två olika cellinjer med genomiska vinster och förluster i samma region ledde till en genomisk nettobalans för den regionen och undgick därmed att upptäckas av CMA, vilket visas i fall 6.
Detektering av mosaikism med hjälp av CMA bygger på avvikelsen från de förväntade logaritmiska förhållandena för deletion eller duplikation utan mosaikism. Den misstänkta mosaikismen måste bekräftas genom kromosomanalys på odlade celler eller FISH-analys, företrädesvis med hjälp av blodutstryk. I 11 fall som studerats här kunde CMA påvisa kromosomavvikelsen, men kunde inte påvisa att det rörde sig om mosaik på grund av en låg andel normala celler eller förekomsten av en isodicentrisk kromosom som leder till segmentell tetrasomi. Till exempel hade två fall en ökning av antalet kopior som upptäcktes av alla prober för kromosom 18 med CMA ( figur 2 ), vilket tyder på trisomi 18. I själva verket visade kromosomanalysen att det ena fallet hade trisomi 18 i alla celler ( figur 2a ), medan det andra fallet hade mosaikism för trisomi 18 i 80 % av cellerna ( figur 2b ). När två eller flera onormala cellinjer involverar samma region, vilket exemplifieras i fallet i figur 2c , är kromosom- och/eller FISH-analyser dessutom viktiga för en korrekt tolkning av kromosomavvikelserna.
Kromosomstrukturell information ges av kromosomanalys men framgår inte av CMA
CMA ger mycket tillförlitlig information om huruvida det förekommer kopianummervinster och kopianummerförluster, men ger inte information om position eller orientering. Våra studier visade att strukturella avvikelser sågs i 18 % av de onormala CMA-fallen. Hälften av de strukturella omarrangemang som identifierades i denna studie är obalanserade translokationer/insertioner, en tredjedel är andra strukturella förändringar såsom ringkromosomer, markeringskromosomer, isokromosomer och isodicentriska kromosomer, och de återstående 15 % är komplexa omarrangemang. Med tanke på att de flesta av dessa strukturella avvikelser involverar subtelomeriska regioner har terminala kopianalyser större sannolikhet att ha ytterligare strukturella avvikelser.17 I allmänhet kan både kromosomanalyser och FISH-analyser identifiera translokationer, insertioner, isokromosomer och markörer, med olika styrka för varje metod. Även om FISH kan upptäcka förändringar som är för små för att kunna upptäckas genom kromosomanalys, ger analys av kromosomernas bandningsmönster ytterligare information om de berörda regionerna. Vid komplexa rearrangemang kan det vara nödvändigt att kombinera FISH och kromosomanalys för att fullständigt fastställa de komplexa strukturella förändringarna. Med detta undantag är FISH-analys efter ett onormalt resultat av CMA vanligtvis tillräcklig för att ge information om arten av förändringen i antalet kopior.
Vissa kromosomala omarrangemang kan missas även efter både CMA och FISH. Till exempel upptäcktes en interstitiell deletion i 2q med CMA i fall 9 ( figur 1a ). Utan kromosomanalys framstår omläggningen som en enkel singeldeletion även efter bekräftande FISH-analys. Undersökning av karyotypen visade dock en onormal kromosom 2 med en insättning av ett segment från 17q23.1q23.3 till band 2p11.2. Dessutom har kromosom 2 med det insatta 17q-segmentet också en pericentrisk inversion mellan 2p12 och 2q31.1. Den deletion på 2q31.1 som upptäcktes med hjälp av CMA inträffade troligen vid eller i närheten av inversionsbrottpunkten på den ena kromosom 2:s långa arm. Sammanfattningsvis kan man säga att fall 9 hade ett komplext omarrangemang med en deletion i 2q som kunde upptäckas med CMA men som inte var synlig med kromosomanalys, samt en insertion och en inversion som involverade kromosomerna 2 och 17 och som kunde upptäckas med kromosomanalys men inte med CMA. På samma sätt hade fall 10 de novo-rearrangemang som involverade fyra kromosomer, inklusive en insättning av segmentet 2q14.2q24.1 i den korta armen av kromosom 6, som också har en paracentrisk inversion, och en reciprok translokation mellan kromosomerna 12 och 18. Kopieringsförluster identifierades med hjälp av CMA nära brytpunkterna i kromosomerna 2 och 6 ( figur 1b ). En korrekt diagnos kräver en kombination av CMA och kromosomanalys.18
Identifiering av kromosomala strukturella omarrangemang är oumbärlig för genetisk rådgivning av familjen. De genomiska obalanser som upptäcks med CMA kan bero på en obalanserad segregeringsprodukt av en balanserad translokation eller insättning hos den ena föräldern och motiverar därför en stark rekommendation att utföra föräldrastudier. Dessutom ger den kromosomala strukturinformationen en vägledning för vilka föräldrastudier som bör rekommenderas. För de omläggningar som sannolikt är produkter av en balanserad omläggning bör föräldra-FISH eller kromosomanalys utföras i stället för föräldra-CMA.
Appenbart balanserade omläggningar med en normal CMA-studie
I den här studien upptäcktes enstaka till synes balanserade translokationer eller inversioner utan andra kromosomavvikelser i 30 fall (~0,8 %) genom kromosomanalys. Det har rapporterats att ~40 % av patienterna med multipla medfödda anomalier/mental retardation och en de novo till synes balanserad translokation har kryptiska avvikelser nära brytpunkterna, eller som inte är relaterade till brytpunkterna, vilket lätt kan upptäckas med CMA.19,20 CMA upptäckte dock inga kopianummerförändringar nära brytpunkterna i dessa 30 fall. Flera faktorer kan bidra till denna observation. De flesta omarrangemangen ärvdes baserat på föräldrastudier av en delmängd av fallen, vilket innebär att det är mer sannolikt att de är ”verkligt” balanserade. Dessutom inkluderades Robertsonianska translokationer, som vanligtvis inte resulterar i kopianummerförändringar av euchromatin, i denna studie men uteslöts i de publicerade studierna. Dessutom kan små kryptiska deletioner/duplikationer i anslutning till brytpunkterna missas eftersom de arrayer som användes för de flesta av dessa fall var riktade och inte hade tillräcklig genomisk upplösning för att upptäcka en obalans.
Och även om majoriteten av balanserade rearrangemang är godartade är de novo-rearrangemang förknippade med en högre sjukdomsrisk på grund av en kryptisk deletion eller duplikation, störning av en gen eller enhancer, positionseffekter eller epigenetisk effekt. Risken att få en allvarlig medfödd anomali för de novo reciproka translokationer och inversioner är 6,7 %.21 Risken förväntas vara lägre för de fall som har en normal CMA med hjälp av en whole-genome array. Därför är det mindre troligt att de enkla balanserade omläggningar som upptäcktes i denna studie är orsaken till patienternas fenotyper.
Evidensbaserad strategi för effektiv upptäckt av kromosomavvikelser
För att avgöra om och när kromosomanalyser bör utföras för klinisk diagnos av kromosomavvikelser undersökte vi resultaten av fall som undersökts samtidigt med både CMA och kromosomanalyser. Kromosomala avvikelser som upptäcktes av kromosomanalys men som helt missades av CMA observerades i ~1 % av fallen, inklusive till synes balanserade omarrangemang i 0,8 % av fallen och obalanser i samband med mosaikism i 0,16 % av fallen. Dessutom underlättade kromosomanalysen upptäckten av kromosomala strukturella omarrangemang i 18 % av fallen med onormala CMA-resultat.
Och även om CMA ger information om variation i antalet kopior och mosaikism, är det endast kromosomanalys eller FISH som ger den kromosomala strukturella information som är förknippad med dessa förändringar i antalet kopior och som identifierar vissa fall av mosaikism som inte upptäcks av CMA. Fördelar med FISH jämfört med kromosomanalys är att små (<3-10 Mb) ändringar i antalet kopior kan upptäckas och att ett stort antal kärnor snabbt kan analyseras, vilket är särskilt användbart för utvärdering av mosaikism. Efter en onormal CMA kan därför FISH-analys först tillämpas för att upptäcka strukturella omarrangemang i samband med kopianummerförändringar och bekräfta mosaikism och bestämma andelen onormala celler. När insertioner eller translokationer upptäcks med FISH kan kromosomanalys vara indicerad för att fastställa vilka kromosomer som är inblandade. I stället för standardkromosomanalyser, där man studerar 20 metafasceller från två kulturer, räcker en småskalig kromosomanalys av fem celler från en kultur för detta ändamål. Denna strategi skulle upptäcka alla strukturella förändringar utom några få sällsynta komplexa omarrangemang.
För fall med ett normalt resultat av CMA kan en fullständig kromosomanalys övervägas om patienten har flera medfödda anomalier, dysmorfiska drag och/eller mental retardation som påminner om ett kromosomalt syndrom eller kliniska manifestationer som tyder på potentiell mosaikism, t.ex. pigmentavvikelser som är slumpmässigt fördelade eller som följer Blashko-linjerna och tillväxtsasymmetri i samband med intellektuell funktionsnedsättning. På grundval av denna studie skulle ~1 % av fallen ha informativa kromosomresultat, men <0,001 av fallen (3/3 710) skulle ha ett kliniskt betydelsefullt fynd.
Sammanfattningsvis bekräftar vår studie ytterligare att nästan alla kromosomavvikelser som kan påvisas med kromosomanalys påvisas med CMA, vilket stödjer rekommendationen om att CMA ska vara det första testet. Traditionell cytogenetisk analys förblir dock användbar för upptäckt av mosaikism och karakterisering av strukturella omarrangemang.