Genkonstruktion, fusionsteknik och TEV-klyvningsförhållanden påverkar reningen av oxiderade disulfidrika giftpeptider i Escherichia coli

Kodonanvändning av giftpeptidkodande gener orsakar uttrycksskillnader

Tjugofyra gener av olika längd som kodar för giftpeptider från olika arter och som innehåller olika antal disulfidbryggor valdes ut för att utforska effekterna av kodonanvändning på lösliga nivåer av renade proteiner. Dessa gener kodar för giftpeptider som är evolutionärt, strukturellt och funktionellt olika. Experimentet syftar till att utvärdera om subtila förändringar i kodonanvändningen kan påverka nivåerna av rekombinant peptiduttryck i E. coli. Tre varianter av varje gen utformades inledningsvis genom backtranslating av sekvenser av giftpeptider med hjälp av en Monte Carlo-algoritm för upprepad slumpmässig provtagning för att välja kodoner på ett sannolikhetsmässigt sätt från tabeller över kodonfrekvenser. Kodonanvändningen för de 72 utformade generna (3 varianter av 24 gener) presenteras i Additional file 5: Table S5 och återspeglar kodonanvändningen för Escherichia coli-gener som uttrycks på måttliga till höga nivåer. De skapade genvarianterna innehöll dock förändringar i DNA:s primära sekvenser som återspeglar det slumpmässiga urvalet av kodonval och den övergripande frihet som tillåts av den algoritm som används för genkonstruktion. Den genomsnittliga parvisa DNA-sekvensidentiteten var således 79,8 % inom de tre varianterna av de 24 datasetten.

De 72 generna syntetiserades och klonades med hjälp av Gateway-systemet i pETG82A prokaryotisk expressionsvektor under kontroll av en T7-promotor och i fusion med genen som kodar för DsbC-fusionstaggen för cytoplasmatiskt uttryck. E. coli BL21 (DE3) pLys S transformerades med de 72 plasmiderna och odlades i autoinduktionsmedier. Fusionsproteiner renades och proteinintegritet och avkastning mättes med hjälp av Caliper Labchip GXII-analys (fig. 1a). Beroende på den aktuella peptiden körs de renade fraktionerna på Caliper Labchip GXII huvudsakligen som ett enda band (peptiderna 1, 2, 3, 4…) eller som ett dubbelt band (5, 8, 16, 18…). Det enkla bandet representerar den goda proteinpopulationen (His-DsbC-peptid) medan det lägre bandet (omkring 29 kDa) motsvarar enbart His-DsbC-proteinet efter trunkering/nedbrytning av målpeptiden. Detta lägre band indikerar troligen att det finns en del av peptidpopulationen som inte var korrekt veckad och som degraderades under expressions- eller reningsprocesserna. Den proteinkoncentration som visas i figur 1b har beräknats genom att integrera endast His-DsbC-peptidbandet med hjälp av Caliper-programvaran. De data som presenteras i figur 1b visar att utbytet av renat fusionsprotein varierade från ∼1 mg/L (för fusionsprotein 14) till över 100 mg/L (för fusionsprotein 4, 5, 8, 9, 10, 18 och 24). För den stora majoriteten av målen (19/24) skulle de renade mängderna fusionsprotein möjliggöra rening av målpeptid i milligramskala per liter kultur (om man antar ett klyvnings- och reningsutbyte på omkring 100 %), medan det för de återstående fem peptiderna (6, 7, 11, 13 och 14) skulle behövas en större kulturvolym.

Korrelationen mellan primär sekvens av genvarianter och egenskaper som har föreslagits påverka uttrycket analyserades. Skadliga motiv, t.ex. 5′-mRNA-sekundärstrukturer, kan inte ha påverkat uttrycksnivåerna eftersom alla giftgener var fusionerade till samma 5′-primsekvens, som kodar för proteinfusionstaggen. Det fanns ingen korrelation mellan proteinuttryck och antalet disulfidbryggor, peptidstorlek, CAI-värde och GC-innehåll (data visas inte). Detta tyder på att skillnaderna i genuttryck bestämdes av andra sekvensrelaterade egenskaper, särskilt av kodonanvändning. För att undersöka hur förändringar i kodonanvändningen påverkade nivåerna av rekombinanta peptider jämfördes förhållandet mellan proteinutbytet för låg-, medel- och höguttryckande varianter inom de 24 datamängderna. Fusionsproteiner som uttrycker sig på lägre nivåer, vilket gäller peptiderna 6, 7, 11, 13 och 14 (fig. 1), uteslöts från analysen. Uppgifterna visade att proteinutbytet för varianterna med hög, medelhög och låg uttrycksnivå för de analyserade peptiderna var signifikant olika. De lägre uttrycksformerna producerade i genomsnitt 65,1 mg/l rekombinant fusionsprotein, medan fusionsproteinutbytet hos de högre uttrycksformerna i genomsnitt var 87,55 mg/l (fig. 1b). Dessa skillnader är signifikant olika (p = 0,01).

För att utvärdera vilka skillnader i kodonanvändning som skulle kunna förklara observerade skillnader i proteinuttryck jämfördes kodonanvändningen hos låg- och höguttryckande varianter. Tabeller över kodonanvändning inklusive gener som innehåller fusionstaggen presenteras i tabell S6. Större skillnader i kodonanvändning gäller särskilt en aminosyra, cystein, även om små förändringar också observerades för andra rester, särskilt arginin, asparagin, glutamat, histidin, isoleucin, fenylalanin och serin. En sammanfattning av kodonanvändningen för dessa åtta aminosyror visas i tabell 1. Den kodonbias som observerades för gener med lågt uttryck visade en preferens för Cys-TGC-kodon, medan Cys-TGT föredras för gener med högt uttryck. Dessutom används Cys-TGC 1,38 gånger oftare än Cys-TGT i gener med lågt uttryck, medan Cys-TGT endast används 1,04 gånger oftare än Cys-TGC i gener med högt uttryck. Även om andra faktorer så småningom kan vara verksamma, tyder denna observation på att ett högt uttryck av gener som kodar för peptider kräver ett liknande bidrag av både Cys-TGC- och Cys-TGT-kodonerna, vilket tyder på att en högre andel av den ena kodonet jämfört med den andra kommer att påverka uttrycket. Cystein-kodonanvändningen i E. coli pekar också på ett mer balanserat utnyttjande av de två kodonerna (tabell 1). För att undersöka faktorer som kan förklara denna observation jämfördes aminosyrafrekvensen i E. coli-gener och inom de 24 giftpeptider som valts ut för denna studie och deras tillhörande fusionsproteiner. Uppgifterna, som presenteras i figur 2, visade att cystein är ~12,5 och 3,5 gånger vanligare i giftpeptiderna (14,3 %) respektive i de rekombinanta fusionsproteinerna (4,1 %) än i E. coli (1,16 %). Uppgifterna tyder således på att uttryck av giftpeptider på höga nivåer gynnas av att de två cystein-kodonerna förekommer lika ofta i syntetiska gener. På så sätt kan man undvika att den ena kodonet utarmas när generna uttrycks på mycket höga nivåer.

Expressionsnivåerna för giftpeptider påverkas av fusionstaggen

Fem nya vektorer för rekombinant proteinexpression i E. coli konstruerades genom att olika fusionstaggar infogades i pHTP1-backbone. Alla fusionstaggar ska införas vid N-terminus av de rekombinanta peptiderna (fig. 3). Två av vektorerna kodar för fusionspartners som innehåller en signalpeptid för att rikta in giftpeptiduttrycket till periplasman (pHTP4, pHTP6). De återstående fusionstaggarna kommer att leda till cytoplasmatiskt rekombinant proteinuttryck (fig. 3). I alla fall infördes en 6HIS-tagg för att möjliggöra nedströmsrening av fusionsproteinerna med hjälp av immobiliserad nickelaffinitetskromatografi. En TEV-proteasklyvningsplats (ENLYFQ/G) infördes i alla syntetiska gener för att möjliggöra avlägsnande av fusionspartnern. Förutom 6HIS-affinitetsmärkningen ensam (pHTP1) innehåller de fem nya vektorerna disulfidisomeraset DsbC eller maltosbindande protein (MBP). Ett inaktivt mutantderivat av DsbC framställdes för att försöka särskilja DsbC:s roll i passiv solubilisering (i förhållande till utbytet av fusionsprotein) och redoxaktivitet (i förhållande till utbytet av korrekt veckad målpeptid). Den schematiska framställningen av alla vektorer som används i denna studie presenteras i fig. 3.

Sexton välkaraktäriserade giftpeptider (inklusive 7 som ingick i experimentet om kodonanvändning som beskrivs ovan) med olika ursprung och som representerar olika veckningar och cysteinbindningsmönster valdes ut för denna studie (se tabell S3). De 16 syntetiska generna sattes in i sex olika expressionsvektorer (se tabell S2 och figur 3) och genererade totalt 96 rekombinanta plasmider. De 96 konstruktionerna transformerades i BL21 (DE3) pLysS. Rekombinanta E. coli-stammar odlades i autoinduktionsmedier för att få hög celltäthet. Efter nickelaffinitetsrening utfördes en systematisk analys av Labchip GXII-elektroherogrammen för att bestämma koncentrationen av de renade proteinerna och för att jämföra den skenbara molekylvikten hos de renade fusionsproteinerna med deras förväntade teoretiska molekylvikt. Data, som presenteras i figur 4, visade att de 16 peptiderna verkligen kan framställas med hjälp av en fusionstagg. Beroende på peptiden och den använda fusionen varierade nivåerna av renade fusionsproteiner från noll (främst när peptiderna klonades i pHTP1) till mer än 300 mg renat fusionsprotein per liter kultur. På det hela taget verkade mindre peptider vara lättare att producera än större peptider, men det finns flera motbevis (t.ex. T16 som är den största peptiden i studien). För peptiderna 2, 4, 7, 8, 9, 14 och 15 verkade olika vektorer vara lämpliga för uttryck av fusionsprotein, men i de flesta fall (13 av 16) överträffade vektor pHTP4 (DsbC) alla andra vektorer. Däremot var det lösliga uttrycket med enbart 6HIS-taggen utan undantag alltid mycket lågt. Närvaron av signalpeptiden ledde till högre uttrycksnivåer för DsbC i alla fall (pHTP4 jämfört med pHTP2) och fördubblade i genomsnitt mängden uttryckt fusionsprotein. För MBP (pHTP6 jämfört med pHTP5) ger dess närvaro en liknande trend (10/16). För de övriga sex peptiderna var antingen den cytoplasmatiska nivån liknande (1, 5, 11) eller till och med betydligt bättre (2, 7, 14). När den periplasmatiska DsbC inte var det bästa alternativet var det cytoplasmatiska (för peptiderna 2 och 14) eller periplasmatiska (peptid 4) MBP som var de bästa alternativen. Slutligen hade inaktiveringen av DsbC:s biologiska funktion ingen effekt på uttrycksnivåerna för fusionsproteiner av giftpeptider, eftersom uttrycket av pHTP2 och pHTP3 i allmänhet var mycket likartat.

Fusionsklyvning, peptidutbyte och korrekt oxidationstillstånd påverkas främst av fusionspartnern och DTT-koncentrationen i TEV-klyvningsbufferten

Optimala TEV-klyvningsförhållanden för att frigöra målpeptider från fusions-taggar påverkas av flera parametrar, bland annat förhållandet mellan enzym och substrat, buffertens sammansättning, inkuberingstid och temperatur. För att undersöka vilka förhållanden som skulle leda till den bästa avkastningen av vikta giftpeptider valdes åtta peptider ut från listan med 16 peptider som producerades i det tidigare experimentet (se tilläggsfil 3: tabell S3, peptider i kursiv stil, och figur 4, peptider i rutor). Eftersom DsbC-fusionspartnern överträffade andra taggar när det gäller avkastning av fusionsprotein och allmän tillämplighet valdes dessa konstruktioner ut för optimeringsstudien av TEV-klyvningen. Den enda parameter som visade sig vara kritisk och som därför finjusterades i detta experiment var DTT-koncentrationen (0, 0,1, 0,5 och 2 mM DTT) i klyvningsbufferten. TEV-proteaset kräver reducerande förhållanden för optimal klyvning, men en för hög koncentration av DTT kan leda till att peptidernas intra-disulfidbryggor reduceras och till förlust av veckning och biologisk aktivitet.

Efter 18 timmars inkubationstid syresattes en alikvot av TEV-fusionspeptidblandningen. En fraktion (”före” kontra ”efter” TEV-klyvning) laddades på Caliper för att bestämma klyvningseffektiviteten och ett prov analyserades på LC-MS för att kvantifiera toxinet och bekräfta dess korrekta oxidationstillstånd. Klyvningseffektivitet, massanalys och peptidutbyte sammanfattas i figur 5. Klyvning skedde under de 32 förhållanden som testades i testet (från 30 till 100 % effektivitet). Som förväntat var klyvningen inte fullständig i avsaknad av DTT och fullständig med den högsta koncentrationen av DTT. Av åtta peptider kunde sju upptäckas oxiderade i mg-mängder per liter kultur. Av de 32 proverna gav 19 den korrekta oxiderade massan på LC-MS med olika utbyten beroende på DTT-koncentrationen under klyvningen. För de 13 återstående proverna upptäcktes inga toppar på LC-MS. Av de sju peptider som korrekt detekterades i olika DTT-koncentrationer gav fyra den högsta återvinningen i 0,1 mM DTT, medan två inte behövde någon DTT och en behövde 0,5 mM DTT för optimal återvinning (fig. 5, med fet stil). En DTT-koncentration på 0,1 mM verkade vara den bästa kompromiss som skulle behållas för de följande experimenten och för VENOMICS-projektets produktionskedja. Alikvantiteter av de 7 peptiderna koncentrerades till 2 och 4 mg/mL och utsattes för samma experiment med 0,1 mM DTT för att bekräfta att klyvning skulle vara möjlig under dessa förhållanden. I genomsnitt sjönk effektiviteten med 20 % men inträffade i alla fall (data visas inte).

Efter optimering av klyvningsförhållandena har de 96 renade fusionsproteinerna (16 i 6 vektorer, se fig. 4) klyvdes i närvaro av 0,1 mM DTT vid koncentrationen av de renade poolerna (oftast från 0,2 till 2 mg/mL) enligt det protokoll som beskrivs ovan. Efter klyvning och syrning analyserades en alikvot av de 96 proverna med LC-MS för att bekräfta den korrekta molekylmassan, utbytet och oxidationstillståndet för den slutliga rekombinanta giftpeptiden. När de 96 rekombinanta peptiderna detekterades hade de 96 rekombinanta peptiderna molekylära massor som stämde överens med de förväntade massorna med tanke på fullt oxiderade cysteinrester (se den åtföljande artikeln för mer information om masspektrometrianalysen); de reducerade formerna av proteinerna detekterades aldrig (data inte visad), vilket troligen berodde på utfällning av felaktigt oxiderade peptider under klyvnings- och syrningsstegen. Det slutliga utbytet för de 96 konstruktionerna, som presenteras i fig. 6, uttrycktes som absolut peptidslututbyte i mg/L kultur eller normaliserades till 100 % för varje peptid i förhållande till den vektor som användes för uttrycket. Data (fig. 6) visade att alla 16 studerade peptider kunde produceras rekombinant, men på olika nivåer. I likhet med den avkastning som erhölls för fusionsvarianterna (fig. 4) tyder en allmän tendens på att de kortare peptiderna är lättare att producera än de längre. Den slutliga avkastningen av giftpeptid varierade kraftigt med en 50-faldig skillnad mellan det sämsta fallet (0,3 mg/L, T10 i pHTP6) och det bästa fallet (17,6 mg/L, T1 i pHTP4). Datasetet visade också att det fanns en betydande minskning av utbytet efter klyvning av fusionstaggar. Detta beror troligen på det hårda återvinningsförhållandet efter klyvning (försurning i 5 % acetonitril, 0,1 % myrsyra) där alla klyvda felveckade peptider fälls ut ovanpå TEV-proteaset. Som förväntat från fusionsutbytet, även om återvinningen är hög, gav peptider producerade med pHTP1 de lägsta mängderna peptider totalt sett (0,4 mg/L i genomsnitt, med ett maximum på 1,9 mg/L för T8). Däremot uppnådde peptider producerade med pHTP4 (DsbC) de bästa slutliga peptidutbytena för 11 av 16 peptider, och av dessa (med undantag för T11) var utbytet mer än 2 mg/L för varje peptid (4,6 mg/L i genomsnitt). Totalt sett producerade DsbC-fusioner (för antingen periplasmatiskt eller cytoplasmatiskt uttryck) framgångsrikt 14 av 16 giftpeptider. Dessutom kunde en peptid (T7) endast produceras i periplasma med hjälp av DsbC-fusionspartnern från pHTP4-vektorn. För peptider som företrädesvis produceras från andra vektorer (T10, 12, 13, 14, 16) överstiger avkastningen inte 2 mg/L, vilket understryker det robusta uttrycket från pHTP4-vektorn. För dessa fem peptider uppnåddes den högsta avkastningen med cytoplasmatiskt uttryck och en DsbC-fusionspartner i tre fall, följt av periplasmatiskt uttryck med MBP-fusionspartner i två fall. I de flesta fall (utom T13,T14 och T16) överträffade fusionen som exporterades till periplasman (för antingen DsbC eller MBP) sin cytoplasmatiska motsvarighet, vilket tyder på att åtminstone en del av veckningen kan ske i periplasman och en del kan ske ex vivo under reningen. Ett slående bevis för att DsbC (och troligen MBP) delvis fungerar som ett passivt lösningsmedel inne i bakterierna är det faktum att medan fusionsutbytet mellan DsbC-konstruktionerna och de muterade DsbC-konstruktionerna var mycket likartat för de flesta peptiderna (fig. 4), så är det totala utfallet av aktiv peptid efter klyvning och återvinning i genomsnitt tre gånger så högt i fallet med den redoxaktiva DsbC-fusionen som i fallet med den muterade DsbC-motsvarigheten. Detaljerna för de kvantitativa värdena har sammanfattats i Additional file 7: Table S7.

Närvaron av den C-terminala (P1′) rest som finns på TEV-klyvningsstället påverkar inte klyvningseffekten på ett signifikant sätt

N-terminalen hos vissa giftpeptider kan bidra till deras receptorbindningsplatser. Det är därför möjligt att införandet av en enda extra rest vid peptidens N-terminus kan påverka dess biologiska aktivitet. Det kanoniska TEV-proteasets igenkänningsställe kräver en Gly- eller Serrest i C-terminus (P1′-positionen), vilket lämnar en icke-nativ Ser- eller Glyrest i målpeptidens N-terminus efter avlägsnande av taggen. I en tidigare studie antyddes det att alla aminosyrans sidokedjor, med undantag av prolin, skulle kunna placeras i P1′-positionen på TEV-proteasets igenkänningsplats utan någon större påverkan på effektiviteten i bearbetningen. Analysen utfördes dock under optimala TEV-buffertförhållanden. För att vara tidseffektiv kan produktionskedjan för giftpeptider inte rymma ytterligare steg, t.ex. buffertbyte till optimala TEV-förhållanden. Därför undersöktes TEV-proteasets förmåga att verka i IMAC-elutionsbufferten (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, DTT 0,1 mM, pH 8), som inte är en optimal buffert för TEV-proteolys. Det TEVSH-proteas som användes i denna studie valdes ut eftersom det är lätt att överproducera och rena i E. coli i mycket stora mängder (upp till 100 mg/L kultur). Den specifika klyvningsspecificiteten hos detta rekombinanta derivat av TEV-proteas är dock fortfarande okänd, särskilt när olika aminosyror upptar P1′-positionen i dess igenkänningsplats (Dr. H. Berglund, personlig kommunikation). För att undersöka aktiviteten hos detta TEVSH-proteas under icke-optimala förhållanden och när P1′-positionen på proteasets igenkänningsställe varieras, producerades 20 sekvenser av testklyvningsfusionsproteiner. Varje fusionsprotein innehöll en N-terminal 6HIS-tagg, en intern TEV-igenkänningssekvens, som var och en innehöll en annan aminosyra i P1´-positionen, fusionerad C-terminalt till en trunkerad form av det DNA/RNA-bindande proteinet Kin17 från Homo sapiens. Proteinerna renades och utsattes för TEV-proteasklyvning under samma förhållanden som användes för att klyva de 96 fusionstaggarna (se ovan). Uppgifterna, som presenteras i figur 7, bekräftar tidigare insamlade uppgifter och tyder på att, med undantag för prolin (sannolikheten för att ha prolin i position 1 i giftpeptider av naturligt ursprung är låg), kan alla andra rester placeras i P1′-positionen på TEV-proteasets igenkänningsställe samtidigt som en viss klyvningsaktivitet bibehålls. Man bör dock ta hänsyn till peptider med en N-terminal Trp, Thr, Leu, Glu, Arg, Asp, Val eller Ile, där klyvningseffektiviteten sjunker till 60 % eller mindre. I dessa fall kan en kompromiss mellan klyvningseffektivitet/produktionsutbyte behöva nås, beroende på hur väl peptiden uttrycks.

Bemärk att till skillnad från giftpeptider innehåller Kin17 inte cysteinrester. Det lyckade klyvningsresultatet när en cysteinrest finns i position 1 (86 %) som erhållits med Kin17 måste därför bekräftas för peptider med en cystein i position 1 som troligen skulle vara involverad i en disulfidbro i det ursprungliga proteinet.