Karaktärisering av den antiinflammatoriska Lactobacillus reuteri BM36301 och dess probiotiska fördelar för åldrade möss

Karaktärisering av probiotiska mjölksyrabakterier

Vi har isolerat mjölksyrabakterier (LAB) i åratal från olika källor, inklusive människor, djur, växter och livsmedelsprodukter. Dessa Benebios Microorganisms (BM) samlingar består av över 500 stammar, med probiotiska potentialer som avslöjats från deras första screeningar. I den här studien valde vi fyra kommensala stammar från avföringsprover och studerade dem ytterligare i detalj (tabell 1). De som särskilt undersöktes var två Lactobacillus reuteri-stammar (BM36301 och BM36304), en L. gasseri-stam (BM33601) och en Bifidobacterium animalis subsp. lactis-stam (BM10307).

Vi undersökte bakterierna med avseende på deras generella kvalifikationer som probiotika (tabell 1). För det första visade dessa BM-stammar motståndskraft mot syror (pH 2,5) och gallsalter (0,3 %) och uppvisade en överlevnadsgrad på mellan 43 % och 98,5 % efter en timmes behandling vid 37 °C, vilket är rimligt höga värden . Därefter testade vi de antimikrobiella aktiviteterna mot tarmbakterier. Medan L. gasseri BM33601 visade en minimal hämning av teststammen E. coli, bildade alla andra tydliga hämmande zoner (0,5-3 mm avstånd från LAB:s kanter). Dessa hämmande effekter orsakas vanligtvis av bakteriociner, organiska syror (mjölksyra eller ättiksyra), väteperoxid eller etanol från LAB . Slutligen tittade vi på deras förmåga att binda till mänskliga tarmepitelceller (IEC) in vitro. För detta ändamål odlade vi mänskliga koloncancerceller, HT-29, på täckglas i 15 dagar och applicerade levande LAB-kulturer på dem i 1 timme (metoder). Efter omfattande tvättning visualiserades de återstående bakteriecellerna genom Gramfärgning för räkning i mikroskop . L. reuteri-stammarna BM36301 och BM36304 uppvisade höga retentionsvärden (5,5-7,4 bakterier per HT-29), medan L. gasseri BM33601 hade måttliga (1,7 bakterier per HT-29) och B. animalis subsp. lactis BM10307 hade låga (0,3 bakterier per HT-29) värden. En starkare vidhäftning av LAB till IEC är särskilt viktigt eftersom de måste stanna i tarmslemhinnan tillräckligt länge för att fördelarna ska få effekt på värden . Från dessa primära experiment visade de två L. reuteri-stammarna högre potential som kvalitetsprobiotika.

Regulering av TNF-α-produktion av mjölksyrabakterier in vitro

Vi syftade till att screena LAB för deras potential att undertrycka tarminflammation. För detta ändamål anpassade vi ett in vitro vävnadskultursystem där de mänskliga myeloida cellerna (THP-1) utsöndrar TNF-α vid aktivering av deras Toll-liknande receptorer (TLR) av bakteriell lipopolysackarid (LPS) . Först verifierade vi att THP-1-celler på 5 × 104 i 1 ml kultur som behandlades med LPS i en dos av 150 ng/ml under 3,5 timmar vanligtvis resulterade i en produktion av 200-300 pg/ml TNF-α (fig. 1a, körfält 1 och 2). Därefter samlade vi upp supernatanterna från bakteriekulturer som odlats i 24 h, vakuumtorkade dem och rekonstituerade det konditionerade mediet (CM) (metoder). Detta CM innehåller komplexa aktiviteter för att både undertrycka och inducera TNF-α, beroende på LAB och odlingsförhållanden . Vi observerade faktiskt en liten produktion av TNF-α av CM från BM36304 och BM36301 utan LPS, men denna mängd var mindre än 20 % av den LPS-stimulerade induktionen (data visas inte). Slutligen tillsatte vi varje CM upp till 5 % av THP-1-kulturen (v/v) i närvaro av LPS (fig. 1a, körfält 3-6). TNF-α-produktionen med LPS (208 ± 49 pg/ml, körfält 2) undertrycktes till 40 % med CM från L. reuteri BM36301 (90,90 ± 49,3 pg/ml, körfält 3) och till 52 % med CM från B. animalis subsp. lactis BM10307 (118,8 ± 19,0 pg/ml, körfält 6). För våra screeningändamål ansåg vi att ett undertryckande av TNF-α nära eller mindre än 50 % av uttrycket genom LPS-behandling var antiinflammatoriskt. CMs från L. reuteri BM36304 och L. gasseri BM33601 kunde dock inte undertrycka TNF-α-produktionen till den punkten. Vi verifierade denna inerta aktivitet genom att förbereda dessa CMs under olika odlingsförhållanden (data visas inte).

Nästan undersökte vi bakteriecellernas TNF-α-inducerande förmåga i själva bakteriecellerna, eftersom cellulära komponenter i grampositiva bakterier kan inducera inflammatoriska reaktioner . För detta ändamål odlade vi bakterier till en exponentiell fas (16 timmar) och skördade, tvättade och tillsatte sedan dessa levande bakterieceller i överskott (250-faldigt antal celler) till THP-1-kulturen. Bakteriecellernas metaboliska aktiviteter hölls minimerade med hjälp av antibiotika som tillsattes i THP-1-mediet. Efter 6 timmars inkubation mättes det utsöndrade TNF-α kvantitativt (fig. 1b). Även om alla fyra LAB-cellerna visade sig inducera TNF-α producerade BM36301 en betydligt mindre mängd (609 pg/ml) än de andra: BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml) och BM10307 (7141 pg/ml). Under denna 6 timmar långa saminkubation observerade vi att THP-1-celler uppvisade varierande celldöd beroende på vilken LAB som användes (Additional file 1). Mest anmärkningsvärt är att BM36301, den lägsta TNF-α-induceraren, orsakade minst mängd THP-1-död (9,7 %), medan de andra högre TNF-α-inducerande stammarna orsakade betydligt mer framträdande död (24-38 %). Därför är det inte så att BM36301 inducerade låg TNF-α på grund av förlust av THP-1:s livskraft i sig. För vår screening betraktade vi LAB med en aktiv TNF-α-produktion på mer än 1000 pg/ml som proinflammatorisk.

Sammanfattningsvis tilldelades de immunmodulerande aktiviteterna in vitro som antiinflammatoriska med den suppressiva CM (BM36301 och BM10307) och proinflammatoriska med de inducerande levande cellerna (BM36304, BM33601 och BM10307). Eftersom BM10307 uppvisade båda aktiviteterna tilldelade vi den dubbel funktionalitet (fig. 1c). Det var intressant att notera att de två L. reuteri-stammarna uppvisade olika aktiviteter. Från den inledande screeningen av vårt breda utbud av BM-samlingar visade sig de antiinflammatoriska stammarna vara ganska sällsynta, med en upptäcktsfrekvens på mindre än 5 % (data visas inte). Även vissa stammar uppvisade ingendera aktiviteten och hamnade därmed i kategorin ”neutral” (data ej visad).

Suppressiva molekyler i CM är stabila mot värme och trypsin

Då CM från LAB består av olika bakteriemetaboliter samt cellulära komponenter, försökte vi bättre förstå den antiinflammatoriska karaktären hos CM. Uttrycket av TNF-α minskade kvantitativt med ökande koncentrationer av CM från L. reuteri BM36301 (fig. 2a) och B. animalis subsp. lactis BM10307 (fig. 2b). Intressant nog inducerade en mindre mängd CM från BM36301 (0,5× input eller 2,5 % v/v) faktiskt TNF-α ytterligare, vilket stämmer överens med observationen att denna CM i viss utsträckning innehåller TNF-α-inducerande material (fig. 2a, körfält 2 och 3). Icke desto mindre blev de undertryckande effekterna dominerande inför högre mängder CM, vilket tyder på att de antiinflammatoriska materialen är kvantitativt additiva och att motsvarande receptorer på THP-1-cellytan är tillräckligt rikliga för att lätt reagera på ökande CM-behandling. Sammantaget tyder dessa observationer på att CM innehåller aktiva metaboliter som är ansvariga för TNF-α-undertryckning, trots deras komplexa natur.

Vi undersökte vidare de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos antiinflammatoriska material i CMs. Kokning av CMs från varje stam i 10 minuter visade sig vara ineffektivt för att förändra deras TNF-α-hämmande funktioner jämfört med nativ CMs (fig. 2c, körfält 3 och 4). På samma sätt påverkade inte heller trypsinbehandling deras aktiviteter (fig. 2c, körfält 5). Dessa observationer tyder på att de viktigaste hämmande faktorerna i dessa CMs varken är proteiner eller värmekänsliga molekyler.

Reglering av TNF-α hos möss med probiotiska bakterier

Den yttersta frågan när det gäller in vitro TNF-α-reglering baserad på vår LAB-screening var hur relevant det skulle vara med in vivo-tillämpningar. Vi försökte direkt besvara denna fråga genom att tillämpa de utvalda L. reuteri-stammarna på ett musmodellsystem. Vi förberedde 20 veckor gamla, inavlade C57BL/6-möss med 6 hanar och 8 honor per grupp. Därefter behandlades en grupp under en 20-veckorsperiod med den antiinflammatoriska BM36301, en annan grupp behandlades med den proinflammatoriska BM36304 och kontrollgruppen behandlades med druvsocker (metoder). Som ett sätt att minimera lidande för djuren administrerades LAB-kulturerna via dricksvatten för att uppfylla den dagliga konsumtionsdosen på 1 × 106 bakterier per mus. Vi gav också en standarddiet så att åldringsprocessen var naturlig under perioden. I slutet av den 20 veckor långa inkubationen (totalt 40 veckors ålder) avlivade vi mössen och tog ut blod för serumberedning för att mäta cytokiner och testosteron med kvantitativa ELISA-metoder. Vid obduktion fann vi inga grova morfologiska avvikelser.

Sammanfattningsvis observerade vi en minskning av TNF-α i serum med det antiinflammatoriska BM36301, med en mer uttalad effekt observerad hos honor. Den proinflammatoriska BM36304 ledde till en ökning av TNF-α hos män, men inte hos kvinnor. Dessa resultat tyder på att vår in vitro-screening bär på en meningsfull relevans med in vivo underhåll av TNF-α i dessa musförsök.

L. reuteri BM36301 upprätthöll minskad viktökning och högt testosteron hos hanmöss

Aldring är källan till många hälsoproblem hos människor, bland annat diabetes och fetma. För att förvärra sådana åldrandeproblem i djurmodellen används ofta fettrika dieter . Tolkningen av dessa påskyndade experiment kan dock vara komplicerad eftersom inget åldrande hos människor bör drivas av en avsiktligt fettrik kost. Vi odlade alla möss med en standarddiet så att deras åldrandeprocess skulle vara så naturlig som möjligt. Under den 20 veckor långa experimentperioden med början vid 20 veckors ålder ökade hanar i kontrollgruppen med cirka 8 g i vikt (7,83 ± 1,2 g) och tikar i kontrollgruppen med cirka 5 g i vikt (4,8 ± 0,94 g). Det var anmärkningsvärt att man märkte att viktökningen hos hanar som utfodrats med det antiinflammatoriska BM36301 var betydligt lägre än hos kontrollgruppen (5,78 ± 0,75 g, p = 0,040) med 36 % (fig. 4a, körfält 1 och 2). Viktökningen hos BM36304-behandlade hanar (7,53 ± 0,74 g) skilde sig dock inte signifikant från kontrollen (p = 0,67). Viktökningen i hongrupperna skiljde sig inte statistiskt från varandra.

En annan signifikant skillnad var insulinnivån i serum från BM36304-behandlade hanar (fig. 4b). Medan den manliga kontrollgruppen uppvisade 3,18 ± 0,65 ng/ml insulin, uppvisade den BM36304-fodrade manliga gruppen 4,91 ± 0,63 ng/ml insulin (p = 0,027). I överensstämmelse med resultatet att viktökningen från denna grupp inte skiljde sig mycket från kontrollen (fig. 4a) observerade vi dock inte någon mer framträdande bukfetmaansamling hos BM36304-behandlade hanar (data visas inte). Vid 40 veckors ålder kan insulinspiken inte ha orsakat kliniskt uppenbar diabetes hos mössen, men sjukdomen kan ha blivit mer uttalad om mössen åldrats ytterligare. Insulinvariationen mellan hongrupperna skiljde sig inte signifikant från varandra.

Slutligt fokuserade vi på hanarnas testosteronnivåer. Som framgår av figur 4c behöll de antiinflammatoriskt BM36301-fodrade hanarna betydligt högre nivåer av serumtestosteron (5,18 ± 0,87 ng/ml) än kontrollgruppen (2,20 ± 0,38 ng/ml, p = 0,0025). Den BM36304-behandlade gruppen skilde sig dock inte statistiskt (3,23 ± 2,10 ng/ml, p = 0,07) från kontrollgruppen. För att ytterligare förstå testosteronresultaten undersökte vi testiklarna hos varje mus. Vikten av parade testiklar hos de BM36301-fodrade hanarna var 0,579 ± 0,075 g, 10 % tyngre än kontrollens (0,525 ± 0,05 g, p = 0,049). Med tanke på den mindre viktökningen i BM36301-gruppen (fig. 4a) är denna storleksskillnad hos testiklarna tydligare; förhållandet mellan testikelvikt och kroppsviktsökning (TW/WG) hos kontrollen var endast 67 % av BM36301-gruppens. Vi kunde dock inte observera mikroskopiska skillnader i vävnaderna från testiklarna, t.ex. diametern på de seminifera tubuli mellan dessa två grupper (156,03 ± 6,65 μm hos kontrollen jämfört med 153,95 ± 18,66 μm hos BM36301-behandlade hanar, p = 0,51). Vi har inte utfört andra studier som att jämföra spermatogenes eller Leydigcellsarea.

Sammanfattningsvis hjälpte det antiinflammatoriska BM36301 männen att bibehålla en lägre viktökning med större testiklar och mer testosteron när de åldrades. Minskad testosteronproduktion hos åldrade män har föreslagits vara relaterad till åldersberoende lesioner i testiklarna, förmodligen som ett resultat av inflammatorisk insult . Samtidigt utlöste den proinflammatoriska BM36304 en ökning av insulin, dock utan förändringar i viktökning eller testosteron hos männen. Noterbart är att ingen av dessa bakteriestammar hade meningsfulla influenser på dessa kroppsmått hos honmöss.

Sund kvinnohud från antiinflammatoriska BM36301

En intressant egenskap hos vissa probiotika är att de kan främja hudens hälsa på ett sätt som är beroende av immunreglering . Eftersom BM36301 också visade antiinflammatoriska effekter in vitro och in vivo ställde vi frågan om denna stam kan framkalla sådana hälsofördelar i huden. Vid den 18:e behandlingsveckan rakade vi ett område på 2 möss från varje grupp och undersökte dem efter 1 vecka. Intressant nog uppvisade BM36301-fodrade honmöss en snabbare återväxt av hår, även om det inte var en fullständig återhämtning, på det rakade området (fig. 5a). Kontroll- eller BM36304-grupperna uppvisade däremot inte en sådan snabb återhämtningstakt. Ingen av de behandlade hanarna uppvisade en håråterväxt som var distinkt snabbare än kontrollen, vilket tyder på att denna snabbare hårtillväxt kan vara uppenbar endast hos honorna. Ett annat mått för att utvärdera hudens hälsa är att undersöka pälsens glans. Vi observerade dock inga meningsfulla skillnader mellan varje grupp genom sensoriska eller ljusmätningsmätningar, främst på grund av de relativt glänsande pälsförhållandena hos kontrollerna (data visas inte).

Vi bedömde vidare hudens hälsa genom att undersöka hudtvärsnitt i mikroskopet efter färgning med Hematoxylin och Eosin. Som visas i fig. 5b och c fann vi att de BM36301-behandlade honmössen visade högre antal subkutana hårsäckar (HF) än kontrollhonmöss. Antalet HF per mikroskopisk vy vid 400× upplösning var 3,50 ± 0,52 för den honliga kontrollgruppen, medan antalet var 4,80 ± 0,61 från BM36301-utfodrade honor med en meningsfull skillnad (p = 0,023). BM36304-behandlade honor uppvisade dock endast en liten förändring (4,15 ± 1,73, p = 0,55 jämfört med kontroll). Vid en mer detaljerad analys av hårsäckarna fann vi att de BM36301-behandlade honorna uppvisade marginellt mer aktiva hårcykelstadier än kontrollen (anagen + katagen: telogen var 81:19 från kontrollen jämfört med 95:5 från BM36301-behandlade honor). Samtidigt skilde sig HF-räkningarna från de manliga grupperna inte mycket från varandra (fig. 5b). Slutligen bedömde vi också hudtjockleken mätt som djupet från epidermis till panniculus carnosus (fig. 5c, Additional file 1). Vi kunde inte hitta någon större skillnad i djupet mellan kontroll- och BM36301-behandlade honor. Däremot visade sig dermalskikten hos BM36301-födda möss vara marginellt djupare än hos kontrollerna, och fettvävnaden från BM36301-behandlade möss var grundare än hos kontrollerna. De flesta subkutana HF:er hittades i dermis.

Sammantaget tyder dessa observationer på att behandlingen med antiinflammatoriska BM36301 främjade en friskare hud, vilket framgår av håråterväxten och antalet HF:er hos honorna. De mikroskopiska skillnaderna i hudproverna mellan kontroll- och BM36301-grupperna verkade dock ganska marginella. Dessa fördelar för hudens hälsa observerades inte hos män. Den proinflammatoriska BM36304 orsakade inte heller några negativa effekter på huden vid tidpunkten för experimenten.