En sexuell produktion av genetiskt identiska organismer är känd som kloning och innebär att ett enda embryo delas, antingen är kärngener och det lilla antalet mitokondriella gener ”identiska”, eller så kan det innebära överföring av kärnan, och i så fall är det bara kärngenerna som är ”identiska”. Efter många års kamp klonade forskare 1995 två lamm ”Megan och Morag” vid Roslin Institute i Skottland, och de klonades från celler från ett tidigt embryo1 , även om amfibier klonades framgångsrikt redan på 1950-talet. Därefter rapporterades att ett antal lamm hade fötts genom kloning. I februari 1997 klonades efter 277 försök ett lamm med namnet ”Dolly”, vars livslängd var betydligt längre än andra klonade lamm.2 Kloningen av Dolly inledde en ny period inom jordbruket med möjlighet till skydd och snabb förökning av utvalda genotyper.3 Hittills har många djur klonats genom kärnöverföring hos däggdjur som får, getter, nötkreatur, kaniner och möss.4 Kloning har många användningsområden och gör det lätt att snabbt föröka önskvärda djurbestånd, föröka transgena djur, göra riktade genetiska förändringar hos husdjur och bevara utrotningshotade arter.1 Men vissa frågor är fortfarande olösta, t.ex. etiska och moraliska frågor och den låga graden av framgång med somatisk cellkärnöverföring på grund av epigenetiska fel till följd av felaktig kärnprogrammering,5 alla dessa faktorer har begränsat kloningens tillfredsställelse och användbarhet inom jordbruket.
Begränsningen av kloning beror på ett komplext samspel mellan många orsaker, t.ex. djurens välbefinnande och bristande tilltro till det klonade djurets hälsa på lång sikt.6 Vid användning av kloningsteknik misslyckas de flesta embryon av till synes god kvalitet under graviditeten eller efter födseln.7 Bristande omprogrammering av den donerade kärnan är den främsta orsaken till misslyckandet, eftersom den är viktig för att det korrekta mönstret för genuttryck ska kunna uppstå under den efterföljande embryogenesen.8 Denna omprogrammering måste ske inom en kort tidsperiod, i en annan cellulär kontext än i den normala utvecklingen, och den är känslig för fel. Det finns allt fler uppgifter som dokumenterar avvikelser i den epigenetiska omprogrammeringen.9
Felprocenten för kloning är mycket hög,10 många klonade embryon kan utvecklas till preimplantationsstadiet, men det stora flertalet kommer inte att resultera i en livskraftig graviditet.11 Trots att man använder friska, fertila, synkrona honor som mottagare rapporterades det att 50 % av fosterförlusterna inträffade under den tidiga första trimestern och att nästan 80 % av fosterförlusterna inträffade under den andra trimestern, främst på grund av avvikelser i moderkakan.12 Enligt studier på kor och får är den dramatiskaste perioden för fosterförlusterna den tid då moderkakan fäster vid placentan.4 Efter avslutad dräktighet har klonade djur större svårigheter att anpassa sig till livet utanför livmodern,13 de ser ut som normala men är genetiskt annorlunda och dessa skillnader beror på epigenetiska avvikelser som förvärvats under kärnreprogrammeringen.10 Många abnormer under dräktighet och neonatalt uppdagas hos klonade djur,12 vilket kan bero på oregelbundet uttryck och sannolikt ofullständig omprogrammering av präglade gener.14 Enligt vissa andra rapporter beror skillnaderna på avvikelser i telomerlängd, genuttryck eller metyleringsmönster.4
Ett annat problem som uppdagas hos klonade djur är placentaabnormiteter. Enligt många forskare beror embryots tidiga död på att moderkakan utvecklas dåligt. Hos klonade djur har man rapporterat om onormal utveckling av det allontoiska membranet och minskad utveckling av placentablodkärl, antalet placentaombildningar är färre hos klonade djur15 och det verkar som om placentans gasutbytesförmåga är avsevärt minskad, eftersom klonade foster i sen dräktighet har befunnits vara hypoxiska16 .
Den klonade avkommans livsduglighet efter födseln är lägre hos klonade djur, men det beror på djuret.17 Efter födseln uppvisade kalvarna oftast andningsproblem18 , problem med hjärt- och kärlsystemet, skelettet och det centrala nervsystemet.7 Potentialen för epigenetiska fel effekter på sammansättningen av klonade djur det är därför säkerhet av livsmedelsprodukter som härstammar hade stora hinder för att få myndighetsgodkännande för inträde i livsmedelskedjan.
Epigenetiska anomalier
Epigenetik innebär ”studiet av mitotiskt och/eller meiotiskt nedärvda förändringar i genernas funktion som inte kan förklaras av förändringar i DNA-sekvensen.19 Enligt teorin ska klonen och donatordjuret ha samma arvsmassa, men det är inte troligt att klonade däggdjur ibland uppvisar utvecklingsavvikelser på grund av epigenetiska fel.20 Ibland växer moderkakan och fostret för mycket, vilket kallas ”Large Offspring Syndrome ”15 , och andra anomalier, t.ex. andningssvårigheter, stora kardiovaskulära avvikelser och förstoringar av organ, ses ofta hos klonade idisslare21 , varför kloningens användbarhet inom jordbruket är mycket begränsad.22
Den praktiska konsekvensen är att det finns många klonade djur som uppför sig och verkar normala, men närmare undersökningar har visat att till och med en del av dessa till synes normala djur skiljer sig subtilt från de naturligt producerade djuren.23 Vid kloning, när en somatisk cell överförs från en donator till en mottagare, måste cellkärnan snabbt omprogrammeras så att den kan anta sitt nya liv som embryonalcell.24 Om cellen inte kan omprogrammeras eller om omprogrammeringen inte är fullständig leder detta i alla fall till att utvecklingen misslyckas och att de överlevande klonerna möjligen uppvisar icke-dödliga abnormiteter.4 En del gener uttrycks korrekt i klonade embryon, t.ex. viktiga metaboliska enzymer, men uttrycket av vissa andra gener är oftast onormalt, vilket påverkar klonens framtida liv. I sådana fall har de flesta kloner uppenbarligen haft en normal graviditet och neonatalperiod, och utsikterna för ett normalt liv verkar goda, men placentautvecklingen och den intrauterina miljön är inte optimal för många kloner, och enbart detta kan påverka deras hälsa senare i livet.25
DNA-metylering spelar en viktig roll för det genuttryck som styr djurens utveckling.5 Det rapporteras att epigenetiska fel framför allt påverkar mönstren för DNA-metylering och kromatinorganisering i klonade embryon.19 Ofta bibehålls donatorcellens mönster av DNA-metylering under utvecklingen före implantation14 vilket leder till effektomprogrammering och som orsakar onormal placentation.26 Sekundärt är det en viktig orsak till det låga födelsetalet.24
Placentaavvikelser
Placenta är det viktigaste organet för materno-fetal kontakt, den spelar en viktig roll för att upprätthålla graviditeten och den upprätthåller fostret genom att tillgodose positiv fördelning av näringsämnen och kritiska endokrina funktioner. Fostrets överlevnad och utveckling under graviditeten är beroende av en lämplig morfologisk och funktionell utveckling av placentan. Kloning är alltid förknippad med placentaavvikelser och indikationer på att placenta inte fungerar vid graviditeter med kärnöverföring är bland annat anomalier som syndromet ”stor avkomma”, förändrade placenta- och fostermembranproteiner, ökad placentavikt samt placentaförstoring och ödem hos nötkreatur.27 Hydroallantois har klassificerats av Farin som ett typ II tillstånd av onormalt avkommasyndrom i Detta patologiska placentatillstånd ökar fostrets fluder och skapar svårigheter att lokalisera fostret i livmoderhornet.27
I tidig dräktighet hos klonade djur är dödligheten hos fostret nära 80 %26 , vilket främst beror på att placentan fungerar dåligt och är underutvecklad.15 Hos nötkreatur går 50-70 % av dräktigheterna på dag 50 förlorade under resten av dräktigheten och fram till terminen på grund av att placentans kärlbildning och fästpunkter saknas, vilket är viktigt för näringsutbytet och för att förhindra att fostret drabbas av hypoxiska tillstånd.7 Under den tredje trimestern hos kor som är dräktiga med klonade foster har det också rapporterats om vissa placentaavvikelser, t.ex. ödem och hydroallantois med en sannolikhet på omkring 45 %.28 Hydroallantois är det vanligaste tillståndet som observeras mellan dag 150 och 180 i klonade dräktigheter.28 Enligt forskningen kan dysfunktionen och utvidgningen av placentan bero på placentaproteiner som visade ett överuttryck av TIMP-229 , men enligt vissa andra kan det bero på ett förändrat genuttryck i trophoblasten i klonade placentor30 .
Svårigheter vid födseln
För närvarande har kloning generellt sett låg effektivitet, vilket beror på en hel del faktorer, t.ex. omprogrammering av kärnan, differentiering av donatorceller och oocytens situation.31 Omprogrammeringsperioden är det viktigaste steget för att optimera kloningen.32 Om omprogrammeringen inte sker på rätt sätt leder det till epigenetiska avvikelser och ökar dödligheten. och somatiskt klonade kalvar är tydligen tyngre än embryonala kloner33 , vilket också är ett exempel på epigenetiska avvikelser som ökar komplikationerna vid födseln.13 Stora foster med alla neonatala abnormiteter på grund av epigenetiska fel kallas ”big calf syndrome”.34 Det är vanligt att dräktighetslängden i kärnöverföringsgraviditeter är mycket lång, vilket beror på att moderkakan inte klarar av att ge fetalt kortisol i nära anslutning till terminen eller på bristande ACTH-frisättning från fostret.26 Hormonell obalans och fostrets stora storlek är steget mot dystoki, som förutom relaterade problem efter förlossningen också kan ha allvarliga negativa effekter på moderns hälsa samt på hennes framtida produktion och reproduktionsförmåga i besättningen.7
Pre- och postnatal livsduglighet
Embryot anses vara av god kvalitet om antalet celler är ganska bra eftersom det är ett viktigt kriterium som verifierar embryots genomförbarhet efter överföring till en surrogatmamma, så ett lågt antal celler i det klonade embryot kommer att kopplas samman med en låg procentsats av överlevnadsförmåga efter embryoöverföring hos flera arter.35 Klonade embryon från nötkreatur med en högre andel apoptotiska blastomerer uppvisade lägre dräktighet efter 90 dagars embryoöverföring och därefter lägre kalvningsfrekvens.36
Postnatal livskraft är markant lägre för många klonade.37 Andelen klonade kalvar som föds och som överlever på längre sikt varierar mellan 47 % och 80 %.38 Vid födseln uppvisar klonade kalvar och lamm ofta tecken på en stressig livmodermiljö; placentareservkapaciteten är troligen begränsad på grund av otillräcklig utveckling.7 Det är uppenbart att fostrets livsduglighet hos klonade djur varierar mellan olika experiment och arter, med klonade möss och getter som uppvisar en bättre livsduglighet efter födseln, vilket kan bero på teknik, djurstam eller placentatyp.26 Några andra fall har också rapporterats om klonade kalvars gula navelsträngar som kan vara en potentiell dödsorsak efter födseln.39 Hos klonade kalvar är förstorade navelvener och artärer också en viktig dödsorsak efter födseln på grund av blodförgiftning i navelsträngen.39
Enligt ny forskning är vaskulära problem också en orsak till postnatal död som pulmonell hypertension, lesioner, ödem och pleurautgjutningar, förutom kapillär kongestion i alveolära septa och pulmonell trombos som orsakar hemodynamiska störningar. Dessa förändringar hindrade sannolikt en fullständig alveolär expansion och förklarade den lunginsufficiens som bidrog till den låga överlevnaden efter födseln hos klonade kalvar.40 Dessa vaskulära utvecklingsproblem var de primära eller viktigaste förändringarna på grund av de epigenetiska modifieringar som orsakades av kloning.
Och även om dessa särskilda epigenetiska avvikelser kan vara mindre och inte utgöra ett välfärdsproblem för djuret kan de begränsa vissa praktiska tillämpningar av tekniken, eftersom de minskar den potentiella enhetligheten hos klonade djur.41 En klonfenotyp som är välkänd för diagonala arter är en bekräftelse på ett nedsatt immunförsvar, med tymisk aplasi hos klonade nötkreatur och lägre antikroppsproduktion hos klonade möss.26 Ett nedsatt immunförsvar kan öka deras benägenhet att drabbas av infektioner och sjukdomar.9
I postpartum av Blodprover som samlats in från de klonade lammen efter födseln avslöjade ett brett spektrum av avvikelser som tyder på njur- och leverdysfunktion.32 Ytterligare förluster under hela den postnatala perioden beror främst på avvikelser i det kardiovaskulära systemet, skelettsystemet och det centrala nervsystemet, navelinfektioner och infektioner i lungorna tillsammans med matsmältnings- och njurstörningar.7 Förlusterna efter födseln är större hos får än hos nötkreatur.26
Fenotyper hos vuxna kloner
Om uttrycksmönstret för gener är onormalt vid tiden för preimplantationen och i de tidiga implantationsstadierna kommer klonens morfologi också att vara onormal.42 I de flesta fall ser klonerna normala ut och har en normal fysiologi, men det finns ändå många rapporter som visar abnormiteter i samband med fenotypen,41 som ”Large Offspring Syndrome”.9 Det beror på fel i genuttrycket vid fostertillväxt och utveckling.43 Förekomsten av dessa anomalier kan variera beroende på art, genotyp, kön, celltyp eller specifika aspekter av kärnöverföringsprotokollet.4
Hög misslyckandefrekvens
Ett hinder för den praktiska användningen av tekniker som innefattar somatisk cellkärnöverföring är den låga möjligheten till klonade embryon; endast några få procent av de rekonstruerade äggcellerna kan alltid utvecklas.43 Fram till nu är andelen lyckade kloningar inom arten 1 %44 , trots att man använder en frisk och synkroniserad mottagare och att embryot som används är av god kvalitet. Hos de flesta däggdjursarter är bedömningen av embryots morfologi fortfarande en metod för att välja ut ett antal praktiskt användbara embryon före överföring. Det är det mest realistiska och kliniskt användbara sättet att bedöma embryots livskraft.14 Men fortfarande rapporteras i de flesta fall betydande graviditetsförluster i tidiga utvecklingsstadier, ungefär vid 30-90 dagars ålder45 , på grund av att placentamembranen inte fungerar och att placentakärlens utveckling minskar39 . Det rapporteras att graviditetsfrekvensen i den tidiga första trimestern är mindre än hälften av den normalt förväntade, att embryoförlusten är mycket hög och att nästan 80 % av fostren misslyckas i den andra trimestern, och att det i den sena dräktigheten finns en hög risk för att det utvecklas placentaavvikelser och dödliga avvikelser jämfört med normalnivån7 . Den främsta orsaken till förluster under tredje trimestern är hydroallantois och fetal hydrops, som vanligen beror på otillräcklig placenta16 . I litteraturen finns också uppgifter om att förlusten av klonade foster också beror på hypoxiska förhållanden, eftersom antalet placenta i klonade djur är mindre, vilket gör att mindre näringsämnen kan utbytas från moderdjuret till fostret och skapar ogynnsamma förhållanden för fostrets utveckling.15Flera författare har övertygande bekräftat att den somatiska donatorcellen omprogrammeras så att uttrycksmönstret i blastocyststadiet skiljer sig avsevärt från den somatiska cellens uttrycksmönster före kärnöverföringen.46 Enligt Arnold et al.,47 uttrycket av gener som är kritiska för normal placentautveckling är missbildat i klonade embryon från nötkreatur, vilket sannolikt leder till onormal differentiering av trofoblasterna och bidrar till att graviditeten går förlorad. Även den pågående avkomman har stora moderkakor och ökad födelsevikt, vilket kallas ”large offspring syndrome ”14 , och vissa med ett till synes friskt utseende drabbas av immundysfunktion, vilket leder till ökad dödlighet.24
Enligt en rapport från Marfil et al.48 har klonade kalvar andningssvårigheter i 19 % av fallen, och i det tillståndet dog kalvarna utan några andra tecken på abnormitet. En förstorad navelsträng 37 %, hyper/hypotermi 17 % och nedtryckt/förlängd liggställning 20 % är de vanligaste dödsorsakerna mellan 24 och 60 dagar efter födseln. Problem som kan minska kalvarnas överlevnad vid eller runt födseln är bland annat ökad längd på dräktigheten, allvarlig dystoki, otillräcklig utveckling och funktion av placentan, misslyckanden i de metaboliska vägar som är nödvändiga för livet utanför livmodern och vissa medfödda problem såsom hypoplasi i lillhjärnan, andningssvårigheter och hjärtförstoring.4
Det kan vara normalt att klonerna är mer känsliga för stress än de konservativa djuren, vilket gör att de är mer benägna att utsättas för patogener, vilket också kan öka dödsfrekvensen hos klonerna.23 För att övervinna kloningens låga effektivitet har olika metoder prövats, t.ex. att använda olika typer av donatorcellinjer, olika odlingssystem, olika fusionsmetoder och kemikalier.35 Vissa av dessa forskningsinsatser har lett till en mindre uppgradering av kvaliteten på klonade embryon, vilket är nära kopplat till embryoutveckling och avkommans produktivitet.
Etik
Kloning av djur är nyckeln till utveckling inom jordbruk och medicin, men den är godtagbar endast när målen och metoderna är etiskt motiverade och när den utförs under etiska förhållanden. Forskare bedriver omfattande forskning om kloning av djur, men nu har många etiska frågor väckts. Kloningens anmärkningsvärda ineffektivitet innebär allvarliga hot mot djurens välbefinnande.49 Ofta leder mindre än en procent av kloningsförsöken till en lyckad födelse, och av dem som föds är det bara en relativt liten andel som är tillräckligt friska för att leva i mer än några dagar eller veckor.35 Enligt en undersökning är 64 procent av USA:s befolkning emot kloning och anser att det strider mot djurens välbefinnande och att det därför är moraliskt fel.50
Den allvarligaste etiska konsekvensen av kloning är den smärta som djuren lider under processen. Människor kan också drabbas hårt av kloning av djur genom att säkerheten hos de djur som används i livsmedelsproduktionen äventyras51 . Vid kloning påverkas både donatorn och mottagaren negativt, eftersom man vid kloning först opererar för att ta bort ägget från donatorn och sedan opererar mottagaren för att implantera ägget med minsta möjliga chans att få ett mål. Om djuret lyckas fullfölja sin dräktighet, kan det av någon okänd anledning bli en hög vikt hos avkomman17 , vilket gör att det oftast krävs kejsarsnitt, vilket leder till att djuret återigen lider av smärta.
Det finns även andra problem som rapporteras där djur lider av smärta och som strider mot djurens välbefinnande, t.ex. hydroallantois, ett typiskt dödligt tillstånd där det dräktiga djuret svullnar upp med vätska till den grad att det ser ut som om det är på väg att spricka48 . Det är uppenbart att embryon som produceras genom kärnöverföring i vissa fall kan leda till en instabil fosterutveckling och till ökad förekomst av dystoki, sectio caesarea och perinatal död, vilket kan ha negativa effekter på mottagaren och avkomman, vilket sammantaget ger upphov till moraliska svårigheter.52 Biologisk mångfald är ett skyddsnät som skyddar mot spridning av sjukdomar hos djur, men kloning är ett försök att fixa en uppsättning önskvärda gener och skapa exakta kopior av ursprungsdjuret, vilket står i motsats till mångfald och ger upphov till en mängd etiska frågor.53
Livsmedelssäkerhet
Varje land har särskilda avdelningar för att ta hand om livsmedel som framställts med hjälp av bioteknik. Animaliska biotekniska produkter måste dock genomgå säkerhetsbedömningar som utförs innan allmänheten och regeringen godkänner att de används som livsmedel.23 Möjligheten att epigenetiska fel kan förändra sammansättningen av livsmedel, vilket är anledningen till att livsmedelsprodukter som härrör från klonade husdjur har varit ett stort hinder för att få ett myndighetsgodkännande för att låta klonade produkter ingå i livsmedelskedjan. Dessutom bekräftade ett utfodringsförsök på råttor att utnyttjandet av kött från klonade djur inte hade någon effekt på kroppstillväxt, födointag, allmäntillstånd, lokomotorisk aktivitet, reflexer, sexuell cykel, urinanalys, hematologi, blodbiokemi eller histologi.23 Med tanke på att tekniken fortfarande betraktas som ny och obekant, plus avsaknaden av produkter med direkta fördelar för dagens konsumenter, är det inte chockerande att den nuvarande acceptansen är låg. Teknikens mognad och tillgången till sådana produkter i kombination med åldrande befolkningar i den utvecklade västvärlden, med en stark önskan att hålla sig frisk längre, kan dock så småningom öka acceptansen.54