Topoisomerasbaserad kloning (TOPO-kloning) är en DNA-kloningsmetod som inte använder restriktionsenzymer eller ligas och som inte kräver några procedurer efter PCR. Låter enkelt, eller hur? Tekniken bygger på den grundläggande förmågan hos de komplementära basparen adenin (A) och tymin (T) att hybridisera och bilda vätebindningar. Det här inlägget fokuserar på TOPO-kloning med ”klibbiga ändar” (även kallad TOPO-TA), men TOPO-kloningstekniken har också anpassats för kloning med trubbiga ändar.
Så hur fungerar TOPO-kloning?
Som illustreras i figuren nedan kommer ”A”-överhänget på den blå PCR-produktinsatsen från användningen av Taq-polymeras för amplifieringssteget, eftersom Taq-polymeras lämnar ett enda deoxyadenosin (A) vid PCR-produkternas 3′-ändar. Det komplementära ”T” i paret kommer från en topoisomeras I-linjäriserad ryggrad. DNA-topoisomeras I (avbildat som ett grönt moln) fungerar både som ett restriktionsendonukleas och som ett ligas genom att klyva och återförena superlindade DNA-ändar för att underlätta replikationen.
TOPO-tekniken använder specifikt Vaccinia-virus-isolerat topoisomeras I, eftersom detta enzym känner igen DNA-sekvensen 5´-(C/T)CCTT-3′ och smälter dubbelsträngat DNA vid denna sekvens. Energin från detta brott lagras som en kovalent bindning mellan den kluvna 3′ DNA-strängen och en tyrosylrest i topoisomeras I (1). Om en 5′ hydroxylgrupp från en annan DNA-sträng kommer kan den angripa denna kovalenta bindning och på så sätt förena de två DNA-strängarna och frigöra topoisomeras (2).
I dag tillhandahåller kommersiellt tillgängliga TOPO-satser vektorer eller kloningsarmar med överhängande 3´ deoxythymidin (T)-rester som är kovalent bundna till topoisomeras. Vektorer i dessa kit har också ofta topoisomerasplatsen infogad i en beta-galaktosidas-kassett, vilket gör det möjligt för forskaren att utföra en blå-vit screening efter transformationen – självförbindning av vektorns ändar resulterar i produktion av blåa kolonier som inte behöver plockas ut och sekvenseras för att hitta potentiellt positiva kloner. När du väl har introducerat ditt 3′-ändiga ”A”-överhängsinsert sker TOPO-kloningens magi.
Grundläggande förfarande
Låt oss dela upp de steg som behövs för TOPO-kloning:
1. Skapa din PCR-produkt: Utforma standardprimer (du behöver inte lägga till unika restriktionsställen i ändarna) och amplifiera din sekvens av intresse med Taq-polymeras med hjälp av ditt favoritprotokoll för PCR.
2. Ställ in TOPO-kloningsreaktionen: Blanda PCR-produkten och TOPO-vektorn.
3. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur: Du kan placera din reaktion på is om du planerar att transformera direkt ELLER du kan förvara reaktionen vid -20C över natten.
4. Transformera TOPO-kloningsreaktionen i kompetenta celler: Du kan använda ditt standardprotokoll för detta, men du bör minska inkubationstiden på is till 5 minuter (att inkubera hela 30 minuter kommer inte att förbättra omvandlingseffektiviteten nämnvärt).
5. Välj ut och analysera 10 vita eller ljusblå kolonier: Du kan bekräfta närvaron av din insättning genom PCR, restriktionsdigest eller sekvensering.
Pro tips
- Tillägg inte 5′-fosfater till dina PCR-primers; du behöver den fria hydroxylgruppen!
- Du kanske vill inkludera extra förlängningstid efter den sista PCR-cykeln för att försäkra dig om att ”A” läggs till på alla PCR-produkter.
- Håll i åtanke att Taq-polymeras har en felfrekvens på cirka 1 på 3 500 baser. Vanligtvis används polymeraser med proofreading-funktionalitet i stället för Taq för att minska felprocenten, men proofreading-polymeraser kommer också att ta bort alla oparade 3′-ändar i din PCR-produkt. Om du behöver minska felprocenten bör du använda en av dessa metoder för att se till att din insättning behåller 3′-A-överhänget:
- Använd en blandning av proofreading-enzym och Taq, där Taq används i ett överskottsförhållande på 10:1.
- Gelrendera din PCR-produkt och inkubera den med buffert, Taq och dATP:er vid 72C i 10-15 minuter.
- När du blandar PCR-produkten med TOPO-vektorn kan du vilja tillsätta extra salt till din reaktion:
Topoisomeras I frigörs från vektorn när PCR-produkten och vektorn ligerar; det kan dock potentiellt binda sig på nytt och göra nickar i det nyligen ligerade DNA:et. Salt hjälper till att förhindra att topoisomeras I återbinds, vilket resulterar i fler intakta molekyler. (Observera att mängden salt du tillsätter beror på om du planerar att transformera din reaktion i kemiskt eller elektrokompetent E. coli – överskott av salt orsakar ljusbågar under elektroporationen, vilket skulle leda till att elektroporationen misslyckas).
- När du inkuberar i rumstemperatur rekommenderas inte att du överskrider tidsgränsen på 5 minuter (lägre transformationseffektivitet har rapporterats med längre inkubation); du kan dock behöva inkubera i 20-30 minuter om din PCR-produkt har låg koncentration eller om du klonar en extremt stor insats.
- Då standardligeringsreaktionen är ganska snabb, se till att du håller dig organiserad och förbereder allt du behöver för nästa steg innan du fortsätter.
-
- Förvärmning av din antibiotikainnehållande platta före utplacering av din omvandling kan göra att du kan se kolonier inom 8 timmar.
1. Shuman S. ”Rekombination medierad av vacciniavirus DNA-topoisomeras I i Escherichia coli är sekvensspecifik”. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10104-8. PubMed PMID: 1658796. PubMed Central PMCID: PMC52876.
2. Ny metod för molekylär kloning och polynukleotidsyntes med hjälp av vaccinia DNA-topoisomeras. Shuman S. J Biol Chem. 1994 Dec 23;269(51):32678-84. PubMed PMID: 7798275.
Olika resurser på Addgene-bloggen
- Utför platsstyrd mutagenes med PCR
- Använd REPLACR-mutagenes för att enkelt generera inlagringar och borttagningar i plasmider
- Lär dig hur du verifierar din plasmid
.