Wässrige Proben, lysierte Zellen oder homogenisiertes Gewebe werden mit gleichen Volumina einer Phenol-Chloroform-Mischung vermischt. Diese Mischung wird dann zentrifugiert. Da das Phenol-Chloroform-Gemisch nicht mit Wasser mischbar ist, bilden sich beim Zentrifugieren zwei unterschiedliche Phasen: eine obere wässrige Phase und eine untere organische Phase. Die wässrige Phase steigt nach oben, weil sie eine geringere Dichte hat als die organische Phase, die das Phenol:Chloroform enthält. Dieser Dichteunterschied ist der Grund, warum Phenol, das nur eine geringfügig höhere Dichte als Wasser hat, mit Chloroform gemischt werden muss, um ein Gemisch mit einer viel höheren Dichte als Wasser zu bilden.
Die hydrophoben Lipide verteilen sich in die untere organische Phase, und die Proteine verbleiben in der Zwischenphase zwischen den beiden Phasen, während die Nukleinsäuren (sowie andere Verunreinigungen wie Salze, Zucker usw.) in der oberen wässrigen Phase verbleiben. Die obere wässrige Phase kann dann abpipettiert werden. Dabei ist darauf zu achten, dass nichts von der organischen Phase oder dem Material an der Grenzfläche mitpipettiert wird. Dieses Verfahren wird häufig mehrfach durchgeführt, um die Reinheit der DNA zu erhöhen. Mit diesem Verfahren erhält man große doppelsträngige DNA, die in der PCR oder RFLP verwendet werden kann.
Wenn die Mischung sauer ist, fällt die DNA in die organische Phase aus, während die RNA in der wässrigen Phase verbleibt. Das liegt daran, dass die DNA leichter neutralisiert wird als die RNA.
Es gibt einige Nachteile dieser Technik in der forensischen Anwendung. Sie ist zeitaufwändig und verwendet gefährliche Reagenzien. Da es sich um einen zweistufigen Prozess handelt, bei dem die Reagenzien von einem Röhrchen zum anderen transferiert werden müssen, ist die Gefahr einer Kontamination größer.