Vodné vzorky, lyzované buňky nebo homogenizovaná tkáň se smíchají se stejným objemem směsi fenol:chloroform. Tato směs se poté odstředí. Protože směs fenol:chloroform je nemísitelná s vodou, při odstřeďování se vytvoří dvě odlišné fáze: horní vodná fáze a spodní organická fáze. Vodná fáze stoupá nahoru, protože je méně hustá než organická fáze obsahující fenol:chloroform. Tento rozdíl v hustotě je důvodem, proč se fenol, který má jen o málo vyšší hustotu než voda, musí smíchat s chloroformem, aby vznikla směs s mnohem vyšší hustotou než voda.
Hydrofobní lipidy se rozdělí do spodní organické fáze a proteiny zůstanou v mezifázi mezi oběma fázemi, zatímco nukleové kyseliny (stejně jako další kontaminanty, jako jsou soli, cukry atd.) zůstanou v horní vodné fázi. Horní vodnou fázi lze poté odpipetovat. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k odpipetování organické fáze nebo materiálu na rozhraní. Tento postup se často provádí vícekrát, aby se zvýšila čistota DNA. Tímto postupem se získá velká dvouvláknová DNA, kterou lze použít při PCR nebo RFLP.
Pokud je směs kyselá, DNA se vysráží do organické fáze, zatímco RNA zůstane ve vodné fázi. Je to proto, že DNA se neutralizuje snadněji než RNA.
Tato technika má při forenzním použití některé nevýhody. Je časově náročná a používá nebezpečná činidla. Také proto, že se jedná o dvoufázový proces zahrnující přenos činidel mezi zkumavkami, hrozí větší riziko kontaminace.