Próbki wodne, zlizowane komórki lub zhomogenizowane tkanki miesza się z równymi objętościami mieszaniny fenol:chloroform. Mieszanina ta jest następnie odwirowywana. Ponieważ mieszanina fenol:chloroform jest niemieszalna z wodą, wirowanie spowoduje powstanie dwóch odrębnych faz: górnej fazy wodnej i dolnej fazy organicznej. Faza wodna unosi się do góry, ponieważ ma mniejszą gęstość niż faza organiczna zawierająca fenol:chloroform. Ta różnica gęstości powoduje, że fenol, który ma tylko nieznacznie większą gęstość niż woda, musi być zmieszany z chloroformem, aby utworzyć mieszaninę o znacznie większej gęstości niż woda.
Hydrofobowe lipidy ulegną podziałowi do niższej fazy organicznej, a białka pozostaną w międzyfazie pomiędzy tymi dwiema fazami, podczas gdy kwasy nukleinowe (jak również inne zanieczyszczenia, takie jak sole, cukry itp.) pozostaną w górnej fazie wodnej. Górną fazę wodną można następnie odpipetować. Należy uważać, aby nie odpipetować żadnej fazy organicznej lub materiału na granicy faz. Procedura ta jest często wykonywana wielokrotnie w celu zwiększenia czystości DNA. W wyniku tej procedury otrzymuje się duże dwuniciowe DNA, które można wykorzystać w PCR lub RFLP.
Jeżeli mieszanina jest kwaśna, DNA wytrąca się do fazy organicznej, podczas gdy RNA pozostaje w fazie wodnej. Dzieje się tak dlatego, że DNA jest łatwiej neutralizowane niż RNA.
Istnieją pewne wady tej techniki w zastosowaniach kryminalistycznych. Jest ona czasochłonna i wykorzystuje niebezpieczne odczynniki. Ponadto, ponieważ jest to proces dwuetapowy, obejmujący przenoszenie odczynników między probówkami, istnieje większe ryzyko skażenia.