Les échantillons aqueux, les cellules lysées ou les tissus homogénéisés sont mélangés à des volumes égaux d’un mélange phénol:chloroforme. Ce mélange est ensuite centrifugé. Le mélange phénol:chloroforme n’étant pas miscible avec l’eau, la centrifugation entraîne la formation de deux phases distinctes : une phase aqueuse supérieure et une phase organique inférieure. La phase aqueuse remonte vers le haut car elle est moins dense que la phase organique contenant le mélange phénol:chloroforme. Cette différence de densité explique pourquoi le phénol, dont la densité n’est que légèrement supérieure à celle de l’eau, doit être mélangé au chloroforme pour former un mélange dont la densité est bien supérieure à celle de l’eau.
Les lipides hydrophobes vont se répartir dans la phase organique inférieure, et les protéines vont rester à l’interphase entre les deux phases, tandis que les acides nucléiques (ainsi que d’autres contaminants tels que les sels, les sucres, etc.) restent dans la phase aqueuse supérieure. La phase aqueuse supérieure peut alors être éliminée à la pipette. Il faut faire attention à ne pas pipeter la phase organique ou le matériel à l’interface. Cette procédure est souvent effectuée plusieurs fois pour augmenter la pureté de l’ADN. Cette procédure permet d’obtenir un grand ADN double brin qui peut être utilisé en PCR ou en RFLP.
Si le mélange est acide, l’ADN précipitera dans la phase organique tandis que l’ARN restera dans la phase aqueuse. Cela s’explique par le fait que l’ADN est plus facilement neutralisé que l’ARN.
Cette technique présente quelques inconvénients dans le cadre d’une utilisation médico-légale. Elle prend du temps et utilise des réactifs dangereux. De plus, étant donné qu’il s’agit d’un processus en deux étapes impliquant le transfert de réactifs entre les tubes, elle présente un plus grand risque de contamination.
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