Una de las contribuciones más duraderas de Winthrop a la Colonia de la Bahía de Massachusetts fue su gran confianza en la religión. Mientras estaban a bordo del Arbella, Winthrop y los demás fundadores expusieron sus esperanzas religiosas para la nueva colonia en un documento llamado «Modelo de Caridad Cristiana». En él exponía cómo los puritanos se mantendrían puros para que Dios siguiera bendiciendo a los colonos mientras esperaban su oportunidad de regresar y salvar a Inglaterra del fuego eterno. Repudiaba la Iglesia de Inglaterra, su jerarquía y sus ceremonias. Sin embargo, caminaban por una línea muy fina, ya que el rey revocaría la carta si descubría que habían renegado de la fe anglicana.
Con el fin de preservar la santidad de la nueva colonia, la disciplina se convirtió en uno de los mayores problemas entre el grupo religioso, gran parte de la cual se llevaba a cabo a nivel familiar. De hecho, la disciplina familiar llegó a ser tan importante que la colonia prohibió que nadie viviera solo, y se exigió a los hombres y mujeres solteros que se mudaran con otras familias.Los asuntos que eran demasiado grandes para que una familia los controlara -los que afectaban a toda la comunidad- llegaban a la Corte General para que los decidiera.La colonia, temerosa de Dios, sufría la influencia del diablo. Winthrop registraba cuidadosamente en su diario las transgresiones de sus compañeros colonos. El castigo fue siempre rápido y duro. Por ejemplo, en uno de los casos más extraños, George Spencer fue ejecutado después de que uno de sus cerdos engendrara un lechón con apariencia humana. A los «santos» de la nueva colonia les resultaba fácil dictar sentencias severas contra los pecadores, ya que sabían que el juicio de Dios sería igual de rápido. Si la iglesia y Dios habían formado parte de la vida cotidiana en Inglaterra, los colonos la convirtieron intencionadamente en su vida entera en el Nuevo Mundo.
La primera iglesia de Massachusetts, una iglesia congregacional en Salem, se había fundado el año anterior a la llegada del grupo de Winthrop. En 1635 había más de una docena de iglesias repartidas por la zona. El proceso para unirse a una iglesia era riguroso, ya que los miembros debían presentarse ante el ministro y explicar su conversión. Sin embargo, Winthrop creía que la mayoría de las personas que viajaban al Nuevo Mundo ya habían demostrado su dedicación a Dios buscando un entorno puro.
La fe puritana creía firmemente en la fuerza del individuo, y rehuía las jerarquías de las iglesias más establecidas, como la Iglesia de Inglaterra y la Iglesia Católica Romana.Sin embargo, uno de los problemas de esta creencia era que la iglesia puritana no tenía una ortodoxia específica ni control sobre lo que enseñaban las iglesias individuales, un descuido que causó varias crisis importantes en la nueva colonia.
En 1631, George Phillips, el pastor de la iglesia de Watertown, comenzó a enseñar a su congregación que tanto la Iglesia de Inglaterra como la Iglesia Católica eran iglesias «verdaderas», lo contrario de lo que sostenía la fe puritana, que era que ambas eran demasiado corruptas para Dios. Winthrop viajó a Watertown para debatir con el pastor delante de la congregación. Al final de la noche, todos los miembros de la iglesia, excepto tres, admitieron que las enseñanzas de Phillips y sus creencias habían sido erróneas.
Una crisis más seria involucró a un predicador bien hablado y encantador llamado Roger Williams. El problema de formar una colonia para atraer a los separatistas religiosos era que a menudo no temían tomar posiciones en contra del gobierno y de las posiciones establecidas de la iglesia, incluso de una iglesia separatista como la propia iglesia puritana.Williams había estado involucrado en el proyecto de la Bahía de Massachusetts desde sus primeros días, incluso asistiendo a la primera reunión en 1629. Cuando Williams llegó al extranjero en medio del primer invierno, Winthrop saludó la llegada del «piadoso ministro». Entonces Williams fue invitado a ser pastor de la iglesia de Boston, pero se negó, creyendo que la iglesia de Boston era demasiado impura para él, ya que no todos en la iglesia condenaban a la Iglesia Anglicana.Winthrop criticó duramente a Williams, calificando sus opiniones de erróneas e insinuando que usaría su autoridad para evitar que la iglesia negociara para conseguir a Williams. Williams se marchó a Salem, no sin antes amenazar con que la autoridad civil de Winthrop no podía intervenir en los asuntos de la iglesia. La iglesia de Salem, dirigida por John Endecott, le recibió con los brazos abiertos hasta que, Winthrop escribió a Endecott «maravillado» de que la ciudad aceptara a un ministro tan peligroso. Williams se instaló finalmente en Plymouth, fuera de la esfera de influencia de Winthrop, pero no se contentó con ello durante mucho tiempo.
En 1633, el gobernador de Plymouth, John Bradford, comentó que Williams había empezado a expresar y practicar «opiniones extrañas», lo que hizo que el predicador abandonara la iglesia. Su queja era que cuando los ciudadanos de Plymouth volvieran a Inglaterra, participarían en los servicios anglicanos, contaminando así la iglesia de Plymouth a su regreso. Williams regresó a Salem, donde la gente lo nombró asistente del ministro, e inmediatamente se dispuso a purificar la iglesia de Salem.
Winthrop y otros líderes coloniales empezaron a cuestionarle sobre una declaración que hizo en Plymouth, que atestiguaba que los colonos no tenían derecho a la tierra que ocupaban. Williams afirmó que el rey gobernaba mediante una «solemne mentira pública» y que no tenía derecho a conceder tierras a la colonia. Winthrop trató de minimizar el enfrentamiento y escribió a Williams, indicándole la forma de matizar sus declaraciones ante el tribunal.Williams se comportó de forma satisfactoria para el tribunal, y no se dijo nada más del incidente.
Sin embargo, en noviembre de 1634, seis meses después de que Winthrop hubiera sido destituido como gobernador, llegó a la corte la noticia de que Williams había empezado a divulgar sus creencias de nuevo. Decía a los colonos que había que reescribir los estatutos o que habría que disolver toda la colonia para «purificarla». Cuando el Tribunal General convocó a Williams, los ministros de la zona pidieron, en cambio, aconsejar al transgresor en privado, evitando así que Williams enviara un borrador de carta al rey acusándolo de mentir. Una y otra vez, durante el año siguiente, Williams fue llamado a comparecer ante el tribunal, cada vez después de haber violado las costumbres de los puritanos. El castigo, sin embargo, tuvo poco efecto en su congregación y, en la primavera de 1635, la iglesia de Salem lo nombró pastor titular.
La Corte General y otros ministros reaccionaron con fuerza.Mientras que las iglesias no pudieron actuar contra Salem para impedir las enseñanzas de Williams, el gobierno civil no tuvo esos reparos.Salem había pedido más tierras en una península cercana y la Corte General anunció que la ciudad sólo podría obtenerlas si destituía a Williams de su cargo, una medida que enfureció a los residentes de Salem. Los habitantes de Salem pidieron ayuda a otras iglesias de la zona, pero sus llamamientos cayeron en saco roto. Mientras el tribunal luchaba contra Salem, toda la colonia podría haberse derrumbado si Williams no hubiera estado confinado en su casa a causa de una enfermedad; sólo podía comunicarse por carta y así su encanto se perdió tanto en Salem como en el tribunal. Pidió al pueblo de Salem que renunciara a todas las demás iglesias y se declarara la única «verdadera», una medida peligrosa y aislante. Salem se opuso.
En una última confrontación, el Tribunal General llamó a Williams a comparecer en octubre de 1635 y le ordenó que abandonara la colonia en seis semanas. Más tarde amplió el plazo hasta la primavera siguiente, pero en enero de 1636 Williams abandonó la bahía de Massachusetts con un grupo de seguidores y se dirigió a la bahía de Narragansett, en la cercana Rhode Island.
Por ahora, la iglesia puritana y su conjunto de creencias estaban a salvo. Winthrop había gestionado hábilmente la mayor crisis a la que se enfrentaba la nueva colonia y, una vez más, la había salvado de una posible ruina.