L’alfa-sinucleina è una proteina legante il DNA che modula la riparazione del DNA con implicazioni per i disturbi dei corpi di Lewy

Gli esseri umani

Il tessuto dei soggetti umani è stato procurato dall’Oregon Alzheimer’s Disease Center (ADC) e dal Dipartimento di Patologia della OHSU e i soggetti affetti avevano diagnosi cliniche e patologiche stabilite (demenza con corpi di Lewy). L’uso del tessuto è stato approvato dall’IRB della OHSU ed eseguito in conformità alle linee guida pertinenti. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti e/o dai loro rappresentanti legali.

Animali

Gli animali sono stati ospitati dal Dipartimento di Medicina Comparata della OHSU in un vivarium con ciclo luce-buio e temperatura e umidità controllate e mantenuti con cibo e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall’OHSU IACUC, tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti, e ogni sforzo è stato fatto per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza.

Generazione del modello di topo

Linee di topo transgeniche

Utilizzando l’OHSU Transgenic Mouse Model Core, abbiamo creato un topo che esprime alfa-sinucleina umana fusa a GFP potenziata (tag C-terminale) contenente una mutazione puntiforme all’alanina 53 (GCA > ACA) che causa un cambiamento dell’aminoacido treonina (A53T Syn-GFP). La sequenza A53T-Syn-GFP è stata clonata nel vettore MoPrp.Xho (dono di David Borchelt)74 nel sito XhoI. L’espressione è sotto il controllo trascrizionale del promotore della proteina prionica del topo. La sequenza di 30 bp linker tra A53T Syn e GFP è GGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC, che si traduce in GlyThrAlaGlyProGlySerIleAlaThr. Questa linea di topi mostra l’espressione A53T Syn-GFP nel >90% dei neuroni corticali e <10% degli astrociti (A.J.S. e V.K.U., dati non pubblicati). 142E Syn-GFP topi transgenici32,33,39,75 e 142E Syn-GFP/mouse mSynKO linee di topo sono stati ottenuti dai creatori della linea, Edward Rockenstein e Eliezer Masliah. Nucleare localizzato TdTomato-NLS topi transgenici sono stati ottenuti dai laboratori Jackson (stock # 023035). Gli animali knock-out dell’alfa-sinucleina e i topi di controllo appropriati sono stati ottenuti dai Jackson Laboratories (stock# 016123, 005304).

Generazione di virus AAV8

Abbiamo creato costrutti virali di A53T Syn-GFP contenenti mutazioni puntiformi nell’alfa-sinucleina alla serina-129 che causano un cambiamento dell’alanina (TCT > GCT) o dell’acido aspartico (TCT > GAT) (dono di Pamela McLean). Questi costrutti sono stati clonati nel vettore virale AAV8 autocomplementare pTRS-KS/CBh-GFP (dal National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, IN), sotto il controllo trascrizionale del promotore CBh (Chicken Beta Actin Short), utilizzando i siti degli enzimi di restrizione AgeI e ApaI. La sequenza di collegamento di 30 bp tra alfa-Syn & potenziata GFP è GGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC. La finale scAAV8-CBh-A53T-S129A-Syn-GFP e scAAV8-CBh-A53T-S129D-Syn-GFP virus sono stati fatti dal Gene Transfer Vector Core al Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Boston, MA.

Iniezioni virali AAV8 intraventricolare

ICV in P0 neonati sono stati fatti seguendo il protocollo mano libera76. Abbiamo iniettato 2 µL di virus non diluito in ogni ventricolo laterale a titoli ~ 1E12 copie genomiche per millilitro. L’unica deviazione da questo protocollo pubblicato è che non abbiamo diluito il virus in trypan blu.

Mouse Lewy patologia induzione

2 a 3 mesi-vecchio topi maschi sono stati iniettati con PFFs sequenza WT mouse secondo i nostri protocolli precedentemente pubblicati25. 2,5 μl (2 mg/ml) appena sonicati PFFs o 2,5 μl PBS è stato iniettato in emisfero destro primaria corteccia sensitivo-motoria in isoflurano (1% al 2%) – animali anestetizzati e restituito alla loro gabbia di casa. Sono stati sacrificati e preparati per IHC come descritto di seguito dopo intervallo post-iniezione di 3-6 mesi (6-9 mesi-vecchio).

Mouse cervello in vivo imaging & analisi

Finestra cranica chirurgia e imaging è stato fatto utilizzando lo stesso protocollo come abbiamo precedentemente pubblicato25,39 in animali anestetizzati isoflurano, utilizzando un microscopio Zeiss LSM 7MP multifotone equipaggiato con doppio canale BiG (binario GaAsP) rivelatori e un Coherent Technologies Chameleon titanio zaffiro sorgente laser pulsato a femtosecondi (sintonizzato a 860 nm per Syn-GFP imaging). Zeiss Zen 2011 software di acquisizione delle immagini è stato utilizzato. Per nucleare danno indotto dal laser (LID) esperimenti, la funzione Bleaching in Zen è stato utilizzato per illuminare piccole regioni di dimensioni submicron all’interno del nucleo con Chameleon laser sintonizzato a ~ 730 nm per < 1 ms). C’è un ritardo di ~ 4 sec necessario per passare il laser da e verso la lunghezza d’onda LID (~ 730 nm). In un sottoinsieme di esperimenti, gli animali sono stati generati che ha espresso Syn-GFP contemporaneamente con nucleare localizzato TdTomato-NLS. Questi hanno dimostrato che la localizzazione dell’impulso LID a regioni > 2 μm dalla periferia della cellula sono stati sempre posizionati all’interno del nucleo. Questo criterio è stato utilizzato per localizzare l’impulso LID all’interno di nuclei di Syn-GFP esprimendo neuroni corticali in vivo. Immagini LID sono stati analizzati con ImageJ in modo simile ai nostri esperimenti FRAP precedentemente descritto 25,39. Regioni di interesse (ROI) sono stati selezionati per ottenere valori medi di fluorescenza in LID e ROI di controllo all’interno del nucleo. Il rapporto tra il segnale ad ogni punto di tempo dal LID rispetto al controllo ROIs è stato utilizzato per calcolare il rapporto di arricchimento. Per gli esperimenti FRAP dopo LID, un protocollo simile photobleaching e analisi è stato utilizzato come il nostro lavoro precedentemente pubblicato 25,39. I dati sono stati analizzati in Prism 6 (GraphPad) per ottenere singoli adattamenti esponenziali al corso del tempo di recupero e le frazioni immobili e mobili. Tutti gli animali utilizzati erano 5 a 9 month-old.

Mouse culture di neuroni corticali e imaging

C57/BL6 topi sono stati utilizzati per generare culture primarie neuronali isolate da topi embrionali, sulla base dei metodi di Kaech e Banker77, e adattato da Gray e colleghi78. Brevemente, gli embrioni sono stati raccolti a 18 giorni di gestazione da femmine anestetizzate. Corteccia è stato sezionato, delicatamente tritato, e tripsinizzato per generare sospensioni di neuroni dispersi. Neuroni corticali appena isolati sono stati elettroporati con plasmidi che codificano due costrutti di alfa-sinucleina umana etichettati con una GFP potenziata (scAAV-huSyn_s129A: EGFP, scAAV-hySyn_s129D: EGFP). 330.000 neuroni corticali elettroporati da ciascun costrutto sono stati placcati su piatti contenenti coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina in mezzo MEM (GIBCO/Life Technologies), 5% FBS (Atlanta Biologicals), e 0,6% di glucosio (Sigma-Aldrich). Dopo 4 ore, il mezzo è stato rimosso e sostituito con Neurobasal Medium integrato con 1 × GlutaMAX (GIBCO/Life Technologies) e 1 × GS21 (MTI-GlobalStem). Ogni piatto è stato alimentato ogni settimana con 0,5 ml di terreno Neurobasal più GlutaMAX e GS21, con la prima alimentazione (a 5 giorni in vitro (DIV)) contenente AraC. Dopo 7 DIV, coprioggetti da neuroni coltivati da ogni costrutto sono stati imaged utilizzando un sistema di cellule vive con una camera di imaging chiuso. Coltura cellulare nucleare LID esperimenti sono stati effettuati sulla stessa piattaforma di imaging utilizzando gli stessi protocolli per l’imaging e l’analisi come il nostro in vivo nucleare LID esperimenti descritti sopra.

Culture ippocampali di topo & PFF semina

Culture ippocampali di topo e PFF semina indotta Lewy patologia formazione è stata effettuata utilizzando le nostre tecniche precedentemente descritto 79,80. Brevemente, colture primarie neuronali sono stati preparati da E16-E18 CD1 cervello di topo (Charles River). Tutte le procedure sono state eseguite secondo la Guida NIH per la cura e l’uso di animali sperimentali e sono stati approvati dalla University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee. Neuroni ippocampali dissociati sono stati placcati su vetrini rivestiti di poli-D-lisina (Carolina Biological Supply) ad una densità di ~ 50.000 cellule / cm2. Ricombinante umano alfa-sinucleina PFFs recanti la mutazione patogena S87N81 sono stati diluiti in PBS a 0,1 mg / ml, sonicato, e diluito in media neuronale. I neuroni sono stati trattati a 5 ug/ml a DIV 7 e incubati per 12 giorni. Le cellule sono state fissate in 4% PFA/4% saccarosio per 15 minuti a temperatura ambiente e poi permeabilizzate in 0.3% Tx-100 e bloccate per 1 ora a temperatura ambiente in 3% FBS/3% BSA. Anticorpi primari (anti-α-Sinucleina PhosphoSer129 clone 81 A, diluizione 1:2000, Biolegend cat#825701; Anti-fosfo-Histone H2A.X (Ser139) clone JBW301, diluizione 1:500, Millipore cat#05-636) sono stati diluiti nel tampone di bloccaggio e incubati a temperatura ambiente per 3 ore. I coprioggetti sono stati poi lavati con PBS 3 volte e incubati con gli appropriati anticorpi secondari marcati Alexa-fluor. I coprioggetti lavati sono stati montati su vetrini usando Fluoromount-G con DAPI (Fisher Scientific).

Anticorpi secondari: Alexa 488, capra anti topo IgG2a, diluizione 1:1000, Fisher Scientific; Alexa 594, capra anti topo IgG1, diluizione 1:1000, Fisher Scientific. Il software HALO (Indica Labs) è stato utilizzato per contare i foci γH2AX e i nuclei colorati con DAPI situati a 1,5 mm dal bordo di ogni vetrino. L’analisi statistica dei dati è stata fatta usando Graphpad Prism versione 4.

Immunofluorescenza & analisi

Cellule HAP1

Controllo WT parentale di Hap1 (voce #C631 lotto 29663) e linee cellulari Hap1 Human SNCA 103 bp deletion knockout (voce #HZGHC003210c003 lotto 2) sono state ottenute da Horizon Discovery e coltivate in media IMDM (Gibco# 11995-065) + 10% di siero bovino fetale + Pen-Strep e coltivate in un incubatore umidificato a 37 C con 5% CO2. Le cellule sono state seminate su PLL rivestite #1.5 coverslips in piatti da 35 mm un giorno prima della fissazione e sono cresciute fino al ~80% di confluenza. Le cellule sono state fissate in 4% PFA in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente (RT), lavate 1 volta in PBS e conservate a 4 C in PBS fino alla procedura di colorazione. Le cellule fissate sono state permeabilizzate con 1 mL di PBS + 0,25% Triton-X 100 agitando delicatamente a RT per 20 minuti. La soluzione è stata rimossa e le cellule sono state bloccate per 20 minuti in 1 mL di tampone di blocco (0,1% Triton-X 100 10% siero di capra normale in PBS). Gli anticorpi primari sono stati diluiti nel tampone di incubazione (diluizione 1:5 del tampone di bloccaggio in PBS) e incubati per una notte a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Il giorno successivo, le cellule sono state lavate 3 volte in PBS per 15 minuti. Gli anticorpi secondari complementari con tag fluorescente sono stati diluiti 1:1000 nel tampone di incubazione, aggiunti alle cellule e incubati a temperatura ambiente, al buio per una notte, con una leggera agitazione. Il giorno successivo, le cellule sono state lavate 3 volte in PBS per 20 minuti. Colorazione nucleare è stato fatto appena prima del lavaggio finale PBS con 2,5ug/mL DAPI (Sigma D9542) in PBS per 20 minuti. Prima del montaggio, le cellule sono state lavate brevemente in H2O deionizzata. I coprivetrini sono stati montati con 13 µL di soluzione antifadante CitiFluor CFMR2 e sigillati con Biotium CoverGrip Coverslip Sealant. I vetrini sono stati ripresi su un microscopio confocale a scansione laser Zeiss Elyra PS.1 710 con software Zen. Z-stacks di 0.5 µm passi sono stati acquisiti a 63x zoom1, con cura presa per non saturare il segnale anticorpale all’interno del nucleo.

Gli anticorpi primari utilizzati sono stati: anti-Syn1, diluizione 1:500, monoclonale di topo, BD Biosciences, cat. 610786; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer clone 10 H, diluizione 1:500, policlonale di pollo, Tulip BioLabs, cat. 1023; anti-fosfo-istone H2A.X, diluizione 1:500, coniglio monoclonale, Cell Signaling, cat. 9718; anti-phosphoS129-Syn EP1536Y, diluizione 1:500, coniglio monoclonale, Abcam, ab51253; anti-phosphoS129-Syn 81 A, monoclonale di topo 1:667diluizione, Covance, cat. 825701; anti-Syn 4B12, diluizione 1:500, monoclonale di topo, Biolegend, cat. 807804; e anti-Syn EPR20535, diluizione 1:100, monoclonale di coniglio, Abcam, ab212184. Gli anticorpi secondari utilizzati sono stati: Alexa Fluor 647 capra anti-rabbit, ThermoFisher cat.A-21245; Alexa Fluor 555 capra anti-topo, Abcam ab150114; Alexa Fluor 488 asino anti-pollo, Jackson ImmunoResearch cat.703-545-155.

Trattamento Bleomycin ICC: Bleomicina solfato (Selleckchem, cat. S1214) polvere è stata diluita in H2O per fare una soluzione stock di 10 mg/mL, aliquotata e conservata a -80C. Un giorno prima del trattamento le cellule Hap1 WT e Hap1 SNCA KO sono state seminate su PLL rivestite #1.5 coprioggetti in piatti da 35 mm per essere ~80% confluenti il giorno seguente. Il giorno del trattamento, i media normali sono stati rimossi e 2 mL di media freschi caldi contenenti 10ug/mL Bleomycin è stato aggiunto a ciascun piatto. Le cellule Sham avevano mezzi freschi caldi, senza Bleomicina, aggiunti ad ogni piatto. Le cellule sono state poste in un incubatore umidificato per 1 ora a 37 C con 5% CO2. Dopo il trattamento, i media sono stati rimossi e le cellule sono state fissate in 4% PFA in PBS per 10 minuti a RT, lavate 1 volta in PBS e conservate a 4 C in PBS fino alla procedura di colorazione.

Bleomicina trattamento Western Blot: Un giorno prima del trattamento le cellule Hap1 WT e Hap1 SNCA KO sono state seminate su piastre da 2 × 10 cm per condizione per essere ~80% confluenti il giorno seguente. Il trattamento con bleomicina è stato fatto come per ICC. Dopo il trattamento, i media sono stati rimossi e le cellule sono state lavate 1 volta con PBS caldo. Le cellule sono state raccolte tramite tripsinizzazione e raccolte in provette coniche da 15 mL pellettate per 5 min 200rcf. Il liquido è stato aspirato, i pellet sono stati risospesi in 2 mL di PBS e trasferiti in 2 × 2 mL di provette da microcentrifuga. Le proteine sono state estratte in frazioni citosoliche e nucleare utilizzando il NE-PER kit di estrazione (Thermo-Fisher, cat. 78833) secondo le raccomandazioni del produttore con l’aggiunta di una breve sonificazione (10 secondi, 10 kHz) dopo il primo passo risospensione nucleare. Le proteine sono state conservate a -80C fino all’analisi Western blot.

Per l’imaging confocale, le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale Zeiss Elyra PS.1 con un obiettivo Plan-Apochromat 63x/1.40 oil. Tutte le analisi di colocalizzazione è stato fatto utilizzando ImageJ (NIH) software per creare ROI per ogni nucleo da una singola immagine situata al centro del nucleo nella direzione z. Il plugin CoLoc 2 è stato utilizzato per misurare il coefficiente di Pearson tra i segnali e il valore di fondo previsto dopo la traslazione casuale di un canale rispetto all’altro.

Cervello di topo

Cervelli di topo maschio (età 3-6 mesi-vecchio) sono stati sezionati immediatamente post mortem, posto in 6 mL di fresco 4% PFA in PBS, e fissato con un Pelco Biowave Pro per 90 minuti a 150 W in un bagno d’acqua circolante. I cervelli sono stati spostati a 4 ° C per continuare a fissare durante la notte. Il giorno successivo il PFA è stato sostituito con lo 0,05% di sodio azide e conservato a 4 ° C fino a ulteriore elaborazione.

Dopo la fissazione, i cervelli sono stati affettati in 50 µm coronale o sagittale sezioni galleggianti utilizzando un Vibratome Leica VT1000S. Per alcuni anticorpi, il recupero degli epitopi indotto dal calore (HIER) è stato richiesto prima del blocco. La fetta di cervello è stata aggiunta a una provetta contenente il buffer HIER (1 mM EDTA, 10 mM Tris Base, 0,05% Tween, pH = 8.5), cotto a vapore per 20 minuti e raffreddato a temperatura ambiente per 20 minuti. Il tessuto è stato bloccato per 1 ora in tampone di blocco (0,1% Triton-X, 10% siero di capra, in PBS). L’anticorpo primario è stato diluito nel tampone di incubazione (diluizione 1:5 del tampone di bloccaggio) ad una concentrazione ottimizzata per ogni anticorpo e incubato durante la notte, al buio, mentre si agitava a temperatura ambiente. Il tessuto è stato lavato per 30 minuti con PBS 5 volte. L’anticorpo secondario complementare è stato diluito nel tampone di incubazione e incubato allo stesso modo per una notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, il tessuto è stato lavato con 5 scambi di PBS. La colorazione con DAPI è stata fatta appena prima del lavaggio finale. Il tessuto è stato montato su un vetrino in CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution. Un coprivetrino #1.5 è stato sigillato sul tessuto con Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Gli anticorpi primari utilizzati sono stati: anti-α-Sinucleina fosfo (Ser129) anticorpo clone 81 A, monoclonale di topo, diluizione 1:667, Biolegend cat#825701; anticorpo anti-alfa Synucleina (fosfo S129), monoclonale di coniglio, diluizione 1:500, Abcam cat#ab51253; Anti-asyn (Syn1/mSyn), monoclonale di topo, 1:500 diluizione, BD Biosciences cat#610786; Anti-pan-ADP-ribose binding reagent, coniglio, diluizione 1:1000, Millipore cat#MABE1016; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer, clone 10 H (PADPR), pollo, diluizione 1:100, Tulip BioLabs cat#1023; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) clone JBW301, topo, diluizione 1:500, Millipore cat#05-636; Anticorpo anti-fosfo-Histone H2A.X (Ser139) clone 20E3, coniglio monoclonale, diluizione 1:500, Cell Signaling cat#9718 Gli anticorpi secondari usati erano: Alexa 647, capra anti-rabbit, diluizione 1:1000, Invitrogen cat#MPA21245; Alexa 647, capra anti-mouse, diluizione 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, capra anti-rabbit, diluizione 1:1000 diluizione, Abcam cat#ab150078; Alexa 555, capra anti-topo, diluizione 1:1000, Abcam cat#ab150114; Alexa 488, capra anti-pollo diluizione 1:1000, Abcam cat# ab150169.

Per l’imaging confocale, le immagini sono state acquisite su uno Zeiss Elyra PS.1 microscopio confocale con un obiettivo Plan-Apochromat 63x/1.40 oil. Potenze laser di 1-5% sono stati utilizzati per acquisire z-stacks attraverso 2-4 regioni di corteccia per sezione di tessuto. Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) software di imaging è stato utilizzato per analizzare i dati IHC. Al fine di segmentare il nucleo dal citoplasma, una superficie è stata creata utilizzando il canale DAPI. Sono stati analizzati solo i nuclei neuronali interi. Le informazioni statistiche (intensità media, intensità somma, numero totale di superfici) per ogni canale sono state esportate e ulteriormente analizzate in Prism 6 (GraphPad). Per l’analisi dei foci all’interno dei nuclei, il segnale nucleare del canale di scelta è stato mascherato utilizzando una superficie nucleare creata dal canale DAPI. Dal segnale nucleare del canale mascherato desiderato, le superfici sono state fatte per quantificare foci nucleari.

Cervello umano

Sezioni dall’amigdala di demenza umana con casi di autopsia Lewy Body sono stati recuperati immediatamente all’autopsia (intervallo post-mortem 12-48 ore), posto in 6 mL di fresco 4% PFA in PBS, e fissato con un Pelco Biowave Pro per 90 minuti a 150 W in un bagno d’acqua circolante. Le sezioni sono state spostate a 4 ° C per continuare a fissare durante la notte. Il giorno successivo il PFA è stato sostituito con 0,05% di sodio azide e conservato a 4 ° C fino a ulteriore elaborazione.

Dopo la fissazione, sezioni di amigdala sono stati affettati in 50 µm sezioni galleggianti utilizzando un Vibratome Leica VT1000S. Il tessuto è stato bloccato per 1 ora in tampone di blocco (0,1% Triton-X, 10% siero di capra, in PBS). L’anticorpo primario è stato diluito nel tampone di incubazione (diluizione 1:5 del tampone di bloccaggio) ad una concentrazione ottimizzata per ogni anticorpo (vedi sotto) e incubato durante la notte, al buio, mentre agitando a temperatura ambiente. Il tessuto è stato lavato per 60 minuti con PBS 5 volte. L’anticorpo secondario complementare è stato diluito nel tampone di incubazione e incubato allo stesso modo per una notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, il tessuto è stato lavato con 5 scambi di PBS. La colorazione con DAPI è stata fatta appena prima del lavaggio finale. Il tessuto è stato montato su un vetrino in CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution. Un coprivetrino #1.5 è stato sigillato sul tessuto con Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Gli anticorpi primari utilizzati sono stati: anti-α-Sinucleina fosfo (Ser129) anticorpo clone 81 A, monoclonale di topo, diluizione 1:667, Biolegend cat#825701; Anti-fosfo-Histone H2A.X (Ser139) anticorpo clone 20E3, monoclonale di coniglio, diluizione 1:500, Cell Signaling cat#9718. Gli anticorpi secondari utilizzati sono stati: Alexa 647, capra anti-topo, diluizione 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 488, capra anti-rabbit, diluizione 1:1000, Abcam cat#ab150077.

Le immagini sono state catturate su uno Zeiss LSM 880 con microscopio Airyscan. Per determinare i segnali specifici dell’anticorpo dall’aumentata colorazione di fondo autofluorescente all’interno dei campioni di tessuto umano, è stato utilizzato un protocollo di unmixing lineare. La modalità Lambda è stata utilizzata per impostare i parametri per l’obiettivo, i laser e i dicroici come richiesto per l’immagine del campione multicolore. Utilizzando gli stessi parametri, gli spettri di riferimento individuali sono stati creati da campioni colorati monocromatici. Inoltre, un campione non colorato è stato utilizzato per determinare gli spettri di riferimento di fondo. Tutti i residui sono stati minimizzati durante la creazione degli spettri di riferimento. Il campione multicolore è stato poi imaged, specificando il fondo rilevante e spettri monocolore, e unmixed utilizzando Zeiss Zen software.

Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) software di imaging è stato utilizzato per analizzare i dati IHC. Al fine di segmentare il nucleo dal citoplasma, una superficie è stata creata utilizzando il canale DAPI. Sono stati analizzati solo i nuclei neuronali interi. Le informazioni statistiche (intensità media, intensità somma, numero totale di superfici) per ogni canale sono state esportate e ulteriormente analizzate in Prism 6 (GraphPad). Per l’analisi dei foci all’interno dei nuclei, il segnale nucleare del canale di scelta è stato mascherato utilizzando una superficie nucleare creata dal canale DAPI. Dal segnale nucleare del canale mascherato desiderato, le superfici sono state fatte per quantificare i foci nucleari.

HAP1 cell comet assay

HAP1 cell neutral comet assay sono stati eseguiti secondo le raccomandazioni di Trevigen (Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K). Sospensioni cellulari (2 × 104 cellule/ml) in IMDM senza siero (Sigma) mescolato in un rapporto 1:2 con Comet LMAgarose (Trevigen) sono stati pipettati su CometSlidesTM (Trevigen) e posto a 4 ° C per 10-15 min per colare. I vetrini sono stati incubati per una notte in Lysis Solution (Trevigen) a 4 °C al buio e poi in un tampone per elettroforesi neutro (300 mM di acetato di sodio, 100 mM di Tris-HCl, pH 9) per 1 ora a 4 °C al buio. I vetrini sono stati elettroforesi in tampone fresco per 40 min a 20 V (1 V/cm) a 4 °C. Dopo l’elettroforesi, i vetrini sono stati incubati prima in tampone di precipitazione del DNA (1 M acetato di ammonio, 86,6% EtOH), e poi il 70% EtOH a temperatura ambiente al buio, per 30 min ciascuno e asciugato a 37 C. I vetrini sono stati colorati con 1X SYBRTMgreen (Invirogen) in 1X PBS (Gibco) a temperatura ambiente per 30 min al buio, immerso in dH2O 10 volte per lavare macchia in eccesso, e asciugato a 37 °C. Le comete sono state visualizzate su uno Zeiss Apotome utilizzando una lente 10X e valutate utilizzando CometScoreTM.

Trattamento con cleomicina Comet Assay: Un giorno prima del trattamento le cellule Hap1 WT e Hap1 SNCA KO sono state seminate su piastre 2 × 35 mm per condizione per essere ~80% confluenti il giorno seguente. Bleomicina e Sham protocolli di trattamento sono stati fatti lo stesso come per ICC. Dopo il trattamento, i media sono stati rimossi e le cellule sono state lavate 1x con PBS caldo. Se è seguito un periodo di recupero, sono stati aggiunti nuovi media caldi e le cellule sono state rimesse nell’incubatrice. Le cellule sono state raccolte mediante tripsinizzazione con 0,05% Tripsina-EDTA (Gibco cat. 15400-54). Le cellule tripsinizzate da piastre 2 × 35 mm sono state raccolte in provette coniche da 15 mL e pellettizzate per 5 min a 200rcf. Il liquido è stato aspirato, il pellet è stato risospeso in 250uL di media freschi senza FBS o Penn-Strep, trasferito in una provetta da microcentrifuga da 2 mL e conservato in ghiaccio fino all’uso nel test Comet come descritto sopra.

Saggio comet del tessuto cerebrale di topo

Il tessuto cerebrale appena estratto da topi maschi (età 1, 3, 6-9 mesi) è stato tritato finemente con una lama di rasoio e sospeso in PBS freddo come il ghiaccio (senza Ca2+ e Mg2+) e omogeneizzato per 30 secondi con un omogeneizzatore manuale. Il tessuto è stato microcentrifugato per un minuto e il surnatante diluito 1:10 in PBS. Le cellule sono state contate con un emocitometro e diluite a 1 × 105/ml. Le cellule diluite sono state combinate con agarosio a bassa fusione (LM) in un rapporto di 1:2 (v/v) e stese sul pozzetto del vetrino per il test della cometa (Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K). I vetrini sono stati asciugati al buio a 4 °C per 15 minuti e sono stati posti nella soluzione di lisi del kit a 4 °C per una notte. Il buffer in eccesso è stato drenato dai vetrini prima dell’immersione in 50 mL di TBE, pH 7,4, per 30 minuti a 4 °C. I vetrini sono stati sottoposti a elettroforesi in TBE, pH 7.4, a 20 V per 40 minuti a 4 °C. L’eccesso di TBE è stato drenato e i vetrini sono stati messi in dH2O due volte per 5 minuti. I vetrini sono stati poi posti in EtOH al 70% per 5 min e asciugati a 37 °C per 15 min. 100 µl di SYBR-Green 1X sono stati pipettati su ogni cerchio di agarosio essiccato e i campioni sono stati colorati per 30 min a temperatura ambiente al buio. La soluzione SYBR-Green in eccesso è stata rimossa e i vetrini sono stati risciacquati più volte in dH2O. I vetrini sono stati lasciati asciugare completamente a 37 °C e conservati a 4 °C. Le comete sono state visualizzate su un microscopio Zeiss ApoTome con un obiettivo 10X e valutate utilizzando il software CometScore™ (TriTek).

Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica

Preparazione del DNA

Frammenti di 300 bp sono stati estratti da una scala di 100 bp (NEB) separati su un gel di agarosio all’1% a 175 V per 2 ore a RT utilizzando il QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Il DNA è stato pulito utilizzando il DNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research), ed eluito in 1X TE. La concentrazione finale e la purezza del DNA sono state determinate da Nanodrop.

Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica

I frammenti di DNA (20 ng) sono stati mescolati con hu_ser129_phospho-syn ricombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg, e 16 µg; Proteos, Inc.), hu_α-sinucleina ricombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg e 16 µg; Proteos, Inc.) o glutatione S-transferasi ricombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg e 16 µg; GenScript) in una reazione da 20 μL contenente 94 mM Tris-Cl, pH 8.0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, e 5% ficoll in ghiaccio per 20 min, poi a temperatura ambiente per 30 min. Dopo l’aggiunta di 2 µL di Orange Loading Buffer 10X (Licor), 8 μL di reazione totale sono stati caricati in un gel di poliacrilammide TBE al 10% o al 6% (Novex) ed eseguiti a 100 V per 2 ore a temperatura ambiente. I gel sono stati colorati per 30 minuti con 10X SYBRTM Safe DNA Stain (Invitrogen) in 1X TBE. Le immagini sono state acquisite utilizzando il sistema di imaging Fluorchem M e quantificate utilizzando ImageJ Gel Analyzing tool.

Western blot

I gel di poliacrilammide TBE al 10% sono stati trasferiti su una membrana di nylon Biodyne™ B (Thermofisher Scientific) a 30 V per 1 ora e 16 minuti in ghiaccio in 0.5X TBE utilizzando il Novex XCell II Blotting System (Invitrogen). Le membrane sono state bloccate per una notte in Odyssey PBS Blocking Buffer (Li-Cor) e colorate per 1 ora a RT con Syn1 (1:1,000; Biolegend) e una notte a 4 °C con IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG (1:10,000; Li-Cor). Le immagini sono state acquisite utilizzando Li-Cor Odyssey CLx Imaging System.

Western Blot per Hap1 prelievi di proteine nucleari: Le concentrazioni dei prelievi di proteine citoplasmatiche e nucleari di Hap1 NE-PER sono state quantificate utilizzando il kit Pierce BCA Protein Assay (Pierce, cat. 23225) e lette su un fotometro per micropiastre Multiskan FC (Fisher, cat. 51119000) con lettura a 550 nm. 5 µg & 10 µg di proteina nucleare sono stati diluiti in tampone campione SDS (Novex, cat. LC2676) + BME (Gibco, cat. 21985-023) e caricati su un gel Tris-Glicina 10-20% (Novex, cat. XP10202BOX). Sono stati caricati 3 µL di ladder proteico colorato (NEB, cat. P7719) come riferimento. Il gel è stato analizzato utilizzando il Novex Xcell Blotting System in SDS running buffer (Novex, cat. LC2675) per 70 min a 120 V. Il gel è stato smontato e preparato per il trasferimento su una membrana Immobilon-FL PVDF (Millipore, cat. IPF00010). Il gel è stato trasferito in tampone di trasferimento Tris-Glicina (Novex, cat. LC3675) in ghiaccio per 2 ore a 25 V. Dopo il trasferimento, la membrana è stata rimossa e immediatamente fissata in 4% PFA + 0,01% Glutaraldeide per 10 minuti con una leggera agitazione a RT. La membrana è stata lavata 1 volta in milliQ H2O e colorata con il kit REVERT total protein stain (LI-COR, cat. 926-11010) secondo il protocollo del produttore. La proteina totale colorata è stata acquisita utilizzando il LI-COR Odyssey CLx Imager. Dopo l’inversione della colorazione REVERT, la membrana è stata lavata 1 volta in milliQ H2O e bloccata in Odyssey Blocking Buffer (LI-COR, cat. 927-40000) per una notte a 4 C con agitazione delicata. Gli anticorpi primari sono stati diluiti 1:1000 in Blocking Buffer e incubati per 2 ore a temperatura ambiente con una leggera agitazione. La membrana è stata lavata 3 volte in 0.1% Tween20 in PBS per 10 minuti. Gli anticorpi secondari (LI-COR IR680LT donkey anti-rabbit cat. 926-68023; IR800CW asino anti-topo cat. 926-32212) sono stati diluiti 1:10000 in tampone di bloccaggio e incubati per 1 ora a temperatura ambiente con leggera agitazione. La membrana è stata lavata 3x in 0.1% Tween20 in PBS per 10 min e 1x in PBS per 10 min, a RT. Le immagini sono state acquisite utilizzando il LI-COR Odyssey CLx Imager. L’analisi è stata fatta su FIJI utilizzando l’analizzatore di gel. Il segnale dell’anticorpo è stato normalizzato alla proteina totale REVERT.

T4 ligasi-mediata test di end-joining del DNA

Ogni reazione di end-joining contiene 150 ng di un prodotto PCR di 1,2 kb di DNA digerito alle estremità 5′ e 3′ con l’enzima di restrizione XhoI (NEB RO146S). Le reazioni vengono effettuate in un volume di reazione di 20 µL contenente 150 ng di DNA digerito, 2,8 µL di tampone proteico (10 mM Tris, 50 mM NaCl pH = 7,6), 5,3 µL di glicerolo al 20% in PBS + Mg + Ca, 2 µL di tampone T4 ligasi, 200 ng o 40,5 ng di proteina, 25U di T4 ligasi (NEB M0202) e H2O sterile fino al volume. Tutti i componenti tranne la ligasi T4 sono stati combinati e incubati in ghiaccio per 15 minuti. 25U T4 ligasi è stato aggiunto alla reazione e incubato a RT per 90 minuti. Dopo l’incubazione, la reazione è stata immediatamente pulita con una colonna Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research) ed eluita in 15 µL di H2O sterile. SybrGreen e il tampone di carico sono stati aggiunti al DNA e i campioni sono stati elettroforesi in un gel di agarosio TAE all’1% per 1 ora a 135 V e ripresi su un imager a chemiluminescenza e fluorescenza Syngene G:BOX. ImageJ è stato utilizzato per analizzare l’immagine del gel e i dati sono stati graficati utilizzando Prism 6 (GraphPad).

Disegno sperimentale & analisi statistica

Tutti i valori quantificati sono riportati come media ± SEM. Il tipo e il numero di campioni (N) e i test statistici utilizzati per valutare la significatività di ogni esperimento sono presentati con ogni set di dati. Le dimensioni del campione utilizzate in ogni esperimento si sono basate sulle stime delle dimensioni attese degli effetti (~10-50%) e sulle deviazioni standard dei dati preliminari e sono state alimentate per rilevare le differenze con un livello di significatività (α) di 0,05 e una potenza di 0,9 (1-β).