Een van de meest blijvende bijdragen van Winthrop aan de Massachusetts Bay Colony was zijn grote vertrouwen in religie. Nog aan boord van de Arbella legden Winthrop en de andere stichters hun religieuze hoop voor de nieuwe kolonie vast in een document dat het “Model van Christelijke Liefdadigheid” werd genoemd. Daarin legde hij uit hoe de Puriteinen zuiver zouden blijven, zodat God de kolonisten zou blijven zegenen terwijl zij wachtten op hun kans om terug te keren en Engeland te redden van het eeuwige hellevuur. Hij verwierp de Kerk van Engeland, haar hiërarchie, en haar ceremonies. De koning zou het handvest intrekken als hij ontdekte dat zij het Anglicaanse geloof hadden verloochend.
Om de heiligheid van de nieuwe kolonie te bewaren, werd discipline een van de grootste problemen binnen de religieuze groep, waarvan veel op gezinsniveau plaatsvond. Gezinsdiscipline werd zelfs zo belangrijk dat het de kolonie verboden werd om alleen te wonen, en alleenstaande mannen en vrouwen werden verplicht om bij andere gezinnen in te trekken. Kwesties die te groot waren voor een gezin om te beheersen – kwesties die de hele gemeenschap beïnvloedden – kwamen voor het Gerechtshof, zodat de godvrezende kolonie te lijden had onder de invloed van de duivel. Winthrop noteerde zorgvuldig de overtredingen van zijn mede-kolonisten in zijn dagboek. De vergelding was altijd snel en hard. In een van de meest bizarre gevallen werd bijvoorbeeld George Spencer terechtgesteld nadat een van zijn varkens een biggetje had verwekt met menselijke gelijkenissen. De “heiligen” van de nieuwe kolonie vonden het gemakkelijk om hard te oordelen over de zondaars onder hen, omdat zij wisten dat het oordeel van God even snel zou zijn. Waren kerk en God in Engeland al een deel van het dagelijks leven geweest, in de Nieuwe Wereld maakten de kolonisten er doelbewust hun hele leven van.
De eerste kerk in Massachusetts, een congregatiekerk in Salem, was gesticht in het jaar voordat Winthrops groep arriveerde. In 1635 waren er meer dan een dozijn kerken verspreid over het gebied. De procedure om lid te worden van een kerk was streng, want leden moesten zich bij de dominee aanmelden en hun bekering uitleggen. Winthrop geloofde echter dat de meeste mensen die de reis naar de Nieuwe Wereld hadden gemaakt, hun toewijding aan God al hadden bewezen door op zoek te gaan naar een zuivere omgeving.
Het puriteinse geloof geloof geloofde sterk in de kracht van het individu, en het schuwde de hiërarchieën van meer gevestigde kerken zoals de Church of England en de Rooms Katholieke Kerk.Een probleem met dit geloof was echter dat de Puriteinse kerk geen specifieke orthodoxie of controle had over wat individuele kerken onderwezen – een onoplettendheid die de nieuwe kolonie in een aantal grote crises bracht.
In 1631 begon George Phillips, de pastoor van de kerk van Watertown, zijn gemeente te onderwijzen dat zowel de Kerk van Engeland als de Katholieke Kerk “ware” kerken waren – het tegenovergestelde van wat het Puriteinse geloof voorstond, namelijk dat beide te corrupt waren voor God. Winthrop reisde naar Watertown om met de pastoor te debatteren ten overstaan van de gemeente. Aan het eind van de avond gaven alle leden van de kerk op drie na toe dat Phillips’ leer en hun geloof fout waren geweest.
Een ernstiger crisis betrof een welbespraakte en charmante predikant met de naam Roger Williams. Het probleem met het stichten van een kolonie om religieuze separatisten aan te trekken was dat zij vaak niet bang waren om stelling te nemen tegen de regering en de gevestigde posities van de kerk, zelfs een separatistische kerk als de Puriteinse kerk zelf. Williams was al vanaf het begin betrokken bij het Massachusetts Bay project, hij woonde zelfs de eerste bijeenkomst in 1629 bij. Toen Williams in het midden van de eerste winter in het buitenland aankwam, begroette Winthrop de komst van de “goddelijke minister”. Vervolgens werd Williams uitgenodigd om pastoor van de Boston kerk te worden maar hij weigerde, omdat hij vond dat de Boston kerk te onzuiver voor hem was omdat niet iedereen in de kerk de Anglicaanse kerk veroordeelde.Winthrop bekritiseerde Williams scherp, noemde zijn opvattingen verkeerd en liet doorschemeren dat hij zijn autoriteit zou gebruiken om de kerk ervan te weerhouden te onderhandelen om Williams te krijgen. Williams vertrok naar Salem, maar niet voordat hij had gedreigd dat Winthrops burgerlijk gezag zich niet met kerkelijke zaken mocht bemoeien. De kerk van Salem, geleid door John Endecott, verwelkomde hem met open armen totdat Winthrop aan Endecott schreef “zich te verbazen” dat de stad zo’n gevaarlijke predikant zou accepteren. Williams vestigde zich uiteindelijk in Plymouth, buiten de invloedssfeer van Winthrop. Daar zou hij niet lang tevreden zijn.
In 1633 merkte gouverneur John Bradford van Plymouth op dat William “vreemde meningen” begon te verkondigen en uit te oefenen, wat er uiteindelijk toe leidde dat de predikant de kerk verliet. Zijn klacht was dat wanneer inwoners van Plymouth terugkeerden naar Engeland, zij zouden deelnemen aan Anglicaanse diensten, waardoor de kerk van Plymouth bij hun terugkeer besmet zou raken. Williams keerde terug naar Salem waar de bevolking hem aanstelde als assistent van de predikant, en hij begon onmiddellijk de Salemse kerk te zuiveren.
Winthrop en andere koloniale leiders begonnen hem te ondervragen over een uitspraak die hij in Plymouth had gedaan, waarin hij verklaarde dat de kolonisten geen recht hadden op het land dat zij in bezit hadden. Williams verklaarde dat de koning regeerde door een “plechtige openbare leugen” en niet het recht had om land aan de kolonie te geven. Winthrop probeerde de confrontatie te minimaliseren en schreef Williams een brief waarin hij hem wees op manieren om zijn uitspraken voor het hof te nuanceren. Williams gedroeg zich naar tevredenheid van het hof en er werd niets meer gezegd over het incident.
In november 1634, zes maanden nadat Winthrop was afgezet als gouverneur, bereikte het hof echter het bericht dat Williams opnieuw met zijn overtuigingen naar buiten was getreden. Hij vertelde de kolonisten dat het handvest moest worden herschreven of dat de hele kolonie zou moeten worden ontbonden om haar te “zuiveren”. Toen het Generaal Gerecht Williams terugriep, vroegen de predikanten van het gebied in plaats daarvan om de overtreder privé te adviseren – en zo te voorkomen dat Williams een opgestelde brief naar de koning zou sturen waarin hij werd beschuldigd van liegen. In het volgende jaar werd Williams steeds opnieuw opgeroepen om voor het hof te verschijnen, telkens na de mores van de puriteinen te hebben geschonden. De straffen hadden echter weinig effect op zijn gemeente en in het voorjaar van 1635 benoemde de kerk van Salem hem tot predikant.
Het Generaal Gerechtshof en andere predikanten reageerden fel.Terwijl de kerken niet in staat waren om tegen Salem op te treden om Williams’ leer te voorkomen, had de burgerlijke regering daar geen moeite mee.Salem had om meer land gevraagd op een nabijgelegen schiereiland, en het Generaal Gerechtshof kondigde aan dat de stad het land alleen kon krijgen als Williams uit zijn functie werd ontheven – een zet die de inwoners van Salem woedend maakte. Zij vroegen andere kerken in de omgeving om hulp, maar hun oproepen waren aan dovemansoren gericht. Terwijl het hof strijd voerde tegen Salem, zou de hele kolonie zijn ingestort als Williams niet aan huis gekluisterd was geweest vanwege een ziekte; hij kon alleen per brief communiceren en daardoor was zijn charme verloren gegaan voor zowel Salem als het hof. Hij vroeg de mensen van Salem om alle andere kerken af te zweren en zichzelf tot de enige “ware” kerk te verklaren – een gevaarlijke en isolerende zet. Salem weigerde.
In een laatste confrontatie riep het Generaal Gerecht William op om in oktober 1635 te verschijnen en beval hem de kolonie binnen zes weken te verlaten. Later werd de termijn verlengd tot de volgende lente, maar in januari 1636 verliet Williams Massachusetts Bay met een groep volgelingen en zette koers naar Narragansett Bay in het nabijgelegen Rhode Island.
Voorlopig waren de puriteinse kerk en hun geloofsovertuiging veilig. Winthrop had de grootste crisis waar de nieuwe kolonie voor stond behendig aangepakt en haar opnieuw van een mogelijke ondergang gered.