Methodes
Het klassieke EMSA-protocol kent 4 grote stappen: 1) De isolatie van eiwitten uit cellen. Aangezien de overgrote meerderheid van actieve DNA-bindende eiwitten aanwezig zijn in de kern, wordt een sequentieel membraan lysis protocol gebruikt dat gezuiverd nucleair eiwit oplevert. 2) Vervaardiging en radioactieve labeling van de DNA-sonde. Fosfor 32 (32P) wordt aan de 5′-uiteinden van de DNA-sonde bevestigd door gebruikmaking van 32P-γATP als substraat voor T4-polynucleotidekinase. DNA-sondes kunnen zowel worden gekocht als op maat worden gemaakt. 3) Gezuiverde eiwitten en radioactief gemerkte DNA-probes worden samen geïncubeerd met een EMSA-bindingsbuffer om de binding van de eiwitten met de DNA-probe te bevorderen. Als een supershift EMSA wordt uitgevoerd, bevat de reactie ook een selectief antilichaam dat, wanneer het aan de eiwit-DNA-complexen wordt gebonden, een verdere vertraging in de gel veroorzaakt. 4) De DNA-eiwitcomplexen worden geladen en over een niet-denaturerende polyacrylamidegel geleid, waardoor de DNA-eiwitcomplexen worden gescheiden van de vrije DNA-sondes. De polyacrylamidegels worden vervolgens gedroogd en via autoradiografie geanalyseerd.