Alfa-synukleina jest białkiem wiążącym DNA, które moduluje naprawę DNA z implikacjami dla zaburzeń z ciałami Lewy’ego

Ludzie

Tkanki ludzkie pozyskano za pośrednictwem Oregon Alzheimer’s Disease Center (ADC) i Wydziału Patologii OHSU, a osoby dotknięte chorobą miały ustalone rozpoznania kliniczne i patologiczne (demencja z ciałami Lewy’ego). Wykorzystanie tkanek zostało zatwierdzone przez IRB w OHSU i przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi. Świadoma zgoda została uzyskana od wszystkich uczestników i/lub ich prawnych przedstawicieli.

Zwierzęta

Zwierzęta były trzymane przez Wydział Medycyny Porównawczej OHSU w wiwarium z regulacją cyklu światło-ciemność oraz temperatury i wilgotności i utrzymywane pod dietą ad libitum z pożywieniem i wodą. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez OHSU IACUC, wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami, a także dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i ich cierpienie.

Generacja modelu myszy

Transgeniczne linie myszy

Używając OHSU Transgenic Mouse Model Core, stworzyliśmy mysz wyrażającą ludzką alfa-synukleinę sprzężoną z wzmocnionym GFP (C-terminalny znacznik) zawierającą mutację punktową na Alaninie 53 (GCA > ACA) powodującą zmianę aminokwasu treoniny (A53T Syn-GFP). Sekwencja A53T-Syn-GFP została sklonowana do wektora MoPrp.Xho (dar Davida Borchelta)74 w miejscu XhoI. Ekspresja odbywa się pod kontrolą transkrypcyjną promotora białka prionowego myszy. Sekwencja łącząca o długości 30 bp pomiędzy A53T Syn i GFP to GGTACCGCGGCCCGATCCATCGCCACC, co tłumaczy się na GlyThrAlaGlyProGlySerIleAlaThr. Ta linia myszy wykazuje ekspresję A53T Syn-GFP w >90% neuronów korowych i <10% astrocytów (A.J.S. i V.K.U., dane niepublikowane). Myszy transgeniczne 142E Syn-GFP32,33,39,75 i linie myszy 142E Syn-GFP/mouse mSynKO uzyskano od twórców linii, Edwarda Rockensteina i Eliezera Masliaha. Myszy transgeniczne z lokalizacją jądrową TdTomato-NLS otrzymano z Jackson Laboratories (stock# 023035). Zwierzęta z nokautem alfa-synukleiny i odpowiednie myszy kontrolne otrzymano z Jackson Laboratories (stock# 016123, 005304).

Powstały konstrukty wirusowe A53T Syn-GFP zawierające mutacje punktowe w alfa-synukleinie przy serynie-129 powodujące albo zmianę aminokwasu alaniny (TCT > GCT) albo kwasu asparaginowego (TCT > GAT) (konstrukty dar Pameli McLean). Te konstrukty zostały sklonowane do samokomplementarnego wektora wirusowego AAV8 pTRS-KS/CBh-GFP (z National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, IN), pod kontrolą transkrypcyjną promotora CBh (Chicken Beta Actin Short), przy użyciu miejsc dla enzymów restrykcyjnych AgeI i ApaI. Sekwencja łącząca 30 bp pomiędzy alfa-Syn & wzmocnionym GFP to GGTACCGCGCGCCCGATCCATCGCCACC. Ostateczne wirusy scAAV8-CBh-A53T-S129A-Syn-GFP i scAAV8-CBh-A53T-S129D-Syn-GFP zostały wykonane przez Gene Transfer Vector Core w Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Boston, MA.

Wstrzyknięcia śródkomorowe wirusa AAV8

ICV u noworodków P0 wykonano zgodnie z protokołem wolnej ręki76. Wstrzyknęliśmy 2 µL nierozcieńczonego wirusa do każdej komory bocznej przy mianie ~1E12 kopii genomowych na mililitr. Jedynym odstępstwem od tego opublikowanego protokołu jest to, że nie rozcieńczaliśmy wirusa w błękicie trypanu.

Indukcja patologii Lewy u myszy

2 do 3-miesięcznym samcom myszy wstrzyknięto mysie PFF sekwencji WT zgodnie z naszymi wcześniej opublikowanymi protokołami25. 2,5 μl (2 mg/ml) świeżo sonikowanych PFFs lub 2,5 μl PBS wstrzykiwano do pierwotnej kory czuciowo-ruchowej prawej półkuli u znieczulonych izofluranem (1% do 2%) zwierząt, które następnie wracały do klatki domowej. Zwierzęta były uśmiercane i przygotowywane do IHC, jak opisano poniżej, po upływie 3-6 miesięcy od iniekcji (6-9 miesięczne).

Obrazowanie in vivo mózgu myszy & analiza

Okno czaszkowe operacja i obrazowanie zostało wykonane przy użyciu tego samego protokołu, który wcześniej opublikowaliśmy25,39 u zwierząt znieczulonych izofluranem, przy użyciu mikroskopu wielofotonowego Zeiss LSM 7MP wyposażonego w dwukanałowe detektory BiG (binarny GaAsP) i femtosekundowe impulsowe źródło laserowe Coherent Technologies Chameleon z tytanu i szafiru (dostrojone do 860 nm do obrazowania Syn-GFP). Zastosowano oprogramowanie Zeiss Zen 2011 do akwizycji obrazów. Do eksperymentów z uszkodzeniem jądra wywołanym laserem (LID) użyto funkcji Bleaching w Zen, aby oświetlić małe, submikronowe regiony wewnątrz jądra laserem Chameleon dostrojonym do długości fali ~730 nm przez <1 ms). Istnieje opóźnienie czasowe ~4 s wymagane do przełączenia lasera na i z długości fali LID (~730 nm). W podzbiorze eksperymentów wygenerowano zwierzęta, które wyrażały Syn-GFP jednocześnie z zlokalizowanym jądrowo TdTomato-NLS. Wykazały one, że lokalizowanie impulsu LID do regionów >2 μm od peryferii komórki były zawsze umiejscowione w obrębie jądra. To kryterium zostało wykorzystane do lokalizacji impulsu LID w obrębie jąder neuronów korowych z ekspresją Syn-GFP in vivo. Obrazy LID były analizowane w programie ImageJ podobnie jak w przypadku wcześniej opisanych eksperymentów FRAP25,39. Obszary zainteresowania (ROI) zostały wybrane w celu uzyskania średnich wartości fluorescencji w LID i kontrolnych ROI w jądrze. Stosunek sygnału w każdym punkcie czasowym z LID w stosunku do ROI kontrolnych został użyty do obliczenia współczynnika wzbogacenia (Enrichment Ratio). Dla eksperymentów FRAP po LID, użyto podobnego protokołu fotobielenia i analizy, jak w naszych wcześniej opublikowanych pracach25,39. Dane były analizowane w Prism 6 (GraphPad) w celu uzyskania pojedynczego dopasowania wykładniczego do przebiegu czasowego regeneracji oraz frakcji nieruchomej i ruchomej. Wszystkie wykorzystane zwierzęta miały od 5 do 9 miesięcy.

Kultury neuronów korowych myszy i obrazowanie

Myszy C57/BL6 użyto do wygenerowania pierwotnych kultur neuronów wyizolowanych z embrionalnych myszy, w oparciu o metody Kaecha i Bankera77, i zaadaptowane od Graya i współpracowników78. Krótko mówiąc, embriony były pobierane w 18 dniu ciąży od znieczulonych samic. Kora została rozczłonkowana, delikatnie rozdrobniona i trypsynizowana w celu wytworzenia zawiesin rozproszonych neuronów. Świeżo wyizolowane neurony korowe elektroporowano plazmidami kodującymi dwa konstrukty ludzkiej alfa-synukleiny znakowanej wzmocnionym GFP (scAAV-huSyn_s129A:EGFP, scAAV-hySyn_s129D:EGFP). 330,000 elektroporowanych neuronów korowych z każdego konstruktu umieszczano na szalkach zawierających pokryte poli-L-lizyną szkiełka nakrywkowe w podłożu MEM (GIBCO/Life Technologies), 5% FBS (Atlanta Biologicals) i 0,6% glukozy (Sigma-Aldrich). Po 4 godzinach pożywkę usuwano i zastępowano pożywką Neurobasal Medium uzupełnioną 1 × GlutaMAX (GIBCO/Life Technologies) i 1 × GS21 (MTI-GlobalStem). Każda szalka była karmiona co tydzień 0,5 ml pożywki Neurobasal plus GlutaMAX i GS21, przy czym pierwsza pożywka (po 5 dniach in vitro (DIV)) zawierała AraC. Po 7 DIV, szkiełka nakrywkowe z hodowanych neuronów z każdego konstruktu były obrazowane przy użyciu systemu żywych komórek z zamkniętą komorą obrazowania. Eksperymenty jądrowego LID z hodowli komórkowych przeprowadzono na tej samej platformie obrazowania, używając tych samych protokołów do obrazowania i analizy, co nasze eksperymenty jądrowego LID in vivo opisane powyżej.

Hodowle hipokampa myszy & PFF seeding

Hodowle hipokampa myszy i PFF seeding indukowane tworzenie patologii Lewy’ego przeprowadzono przy użyciu naszych wcześniej opisanych technik79,80. W skrócie, pierwotne kultury neuronalne zostały przygotowane z mózgów myszy E16-E18 CD1 (Charles River). Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z NIH Guide for the Care and Use of Experimental Animals i zostały zatwierdzone przez University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee. Zdysocjowane neurony hipokampa umieszczano na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną (Carolina Biological Supply) w gęstości ~50,000 komórek/cm2. Rekombinowaną ludzką alfa-synukleinę PFF z patogenną mutacją S87N81 rozcieńczono w PBS w stężeniu 0,1 mg/mL, poddano sonikacji i rozcieńczono w pożywce dla neuronów. Neurony poddawano działaniu 5 ug/ml w DIV 7 i inkubowano przez 12 dni. Komórki utrwalano w 4% PFA/4% sacharozie przez 15 min w temperaturze pokojowej, a następnie permeabilizowano w 0,3% Tx-100 i blokowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej w 3% FBS/3% BSA. Przeciwciała pierwotne (anty-α-Synukleina PhosphoSer129 klon 81 A, rozcieńczenie 1:2000, Biolegend cat#825701; anty-fosfo-Histone H2A.X (Ser139) klon JBW301, rozcieńczenie 1:500, Millipore cat#05-636) rozcieńczano w buforze blokującym i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie szkiełka nakrywkowe przemywano 3-krotnie PBS i inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi Alexa-fluorem. Wypłukane szkiełka naklejano na szkiełka przy użyciu Fluoromount-G z DAPI (Fisher Scientific).

Przeciwciała drugorzędowe: Alexa 488, kozie anty mysie IgG2a, rozcieńczenie 1:1000, Fisher Scientific; Alexa 594, kozie anty mysie IgG1, rozcieńczenie 1:1000, Fisher Scientific.

Do obrazowania szkiełek nakrywkowych użyto skanera PE lamina Scanner. Oprogramowanie HALO (Indica Labs) zostało użyte do policzenia ognisk γH2AX i jąder wybarwionych DAPI zlokalizowanych 1,5 mm od krawędzi każdej szkiełka nakrywkowego. Analiza statystyczna danych została przeprowadzona przy użyciu programu Graphpad Prism w wersji 4.

Immunofluorescencja & analysis

Komórki HAP1

Linie komórkowe Hap1 parental WT control (item #C631 batch 29663) i Hap1 Human SNCA 103 bp deletion knockout (item #HZGHC003210c003 batch 2) uzyskano od Horizon Discovery i hodowano w podłożu IMDM (Gibco# 11995-.065) + 10% Fetal Bovine Serum + Pen-Strep i hodowane w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 C z 5% CO2. Komórki były wysiewane na szkiełkach nakrywkowych #1.5 pokrytych PLL w szalkach 35 mm dzień przed utrwaleniem i hodowane do ~80% konfluencji. Komórki utrwalano w 4% PFA w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), przemywano 1x w PBS i przechowywano w temperaturze 4 C w PBS do czasu procedury barwienia. Utrwalone komórki były permeabilizowane w 1 mL PBS + 0,25% Triton-X 100 delikatnie wstrząsając w RT przez 20 minut. Roztwór usunięto i komórki blokowano przez 20 minut w 1 mL Blocking Buffer (0,1% Triton-X 100, 10% normalnej surowicy koziej w PBS). Przeciwciała pierwotne rozcieńczano w Incubation Buffer (rozcieńczenie 1:5 Blocking Buffer w PBS) i inkubowano przez noc w temperaturze RT, delikatnie wstrząsając. Następnego dnia komórki płukano 3x w PBS przez 15 minut. Komplementarne, znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe rozcieńczano w stosunku 1:1000 w Incubation Buffer, dodawano do komórek i inkubowano w temperaturze RT, w ciemności, przez noc, delikatnie wstrząsając. Następnego dnia komórki płukano 3x w PBS przez 20 minut. Barwienie jądrowe wykonano tuż przed końcowym płukaniem PBS za pomocą 2,5ug/mL DAPI (Sigma D9542) w PBS przez 20 minut. Przed montażem komórki płukano krótko w dejonizowanej H2O. Szkiełka przykrywano 13 µL CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution i uszczelniano za pomocą Biotium CoverGrip Coverslip Sealant. Szkiełka obrazowano w laserowo skanującym mikroskopie konfokalnym Zeiss Elyra PS.1 710 z oprogramowaniem Zen. Z-stacks of 0.5 µm steps were acquired at 63x zoom1, with care given to never saturate antibody signal within the nucleus.

Primary antibodies used were: anti-Syn1, 1:500 dilution, mouse monoclonal, BD Biosciences, cat. 610786; anty-Poly(ADP-Ribose) Polymer clone 10 H, rozcieńczenie 1:500, chicken polyclonal, Tulip BioLabs, cat. 1023; anty-fosfo-histon H2A.X, rozcieńczenie 1:500, monoklonalne królicze, Cell Signaling, nr kat. 9718; anti-phosphoS129-Syn EP1536Y, 1:500 dilution, rabbit monoclonal, Abcam, ab51253; anti-phosphoS129-Syn 81 A, 1:667dilution mouse monoclonal, Covance, cat. 825701; anty-Syn 4B12, rozcieńczenie 1:500, monoklonalny mysi, Biolegend, nr kat. 807804; i anty-Syn EPR20535, rozcieńczenie 1:100, monoklonalne królicze, Abcam, ab212184. Przeciwciałami drugorzędowymi były: Alexa Fluor 647 kozi anty-rabbit, ThermoFisher cat.A-21245; Alexa Fluor 555 kozi anty-mouse, Abcam ab150114; Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken, Jackson ImmunoResearch cat.703-545-155.

Traktowanie bleomycyną ICC: Siarczan bleomycyny (Selleckchem, nr kat. S1214) w proszku rozcieńczono w H2O, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 10 mg/mL, alikwotowano i przechowywano w -80C. Jeden dzień przed traktowaniem komórki Hap1 WT i Hap1 SNCA KO były wysiewane na szkiełkach nakrywkowych #1,5 pokrytych PLL w naczyniach 35 mm, aby następnego dnia uzyskać ~80% konfluencji. W dniu traktowania, normalne medium zostało usunięte i 2 mL świeżego ciepłego medium zawierającego 10ug/mL Bleomycyny zostało dodane do każdego naczynia. Komórki Sham miały dodaną świeżą, ciepłą pożywkę bez Bleomycyny do każdego naczynia. Komórki umieszczano w nawilżanym inkubatorze na 1 godzinę w temperaturze 37 C z 5% CO2. Po leczeniu, media zostały usunięte, a komórki zostały utrwalone w 4% PFA w PBS przez 10 minut w RT, przemyte 1x w PBS i przechowywane w 4 C w PBS do procedury barwienia.

Traktowanie Bleomycyną Western Blot: Jeden dzień przed leczeniem komórki Hap1 WT i Hap1 SNCA KO były wysiewane na płytki 2 × 10 cm na warunek, aby być ~80% konfluentne następnego dnia. Traktowanie bleomycyną przeprowadzono tak samo jak w przypadku ICC. Po leczeniu, media zostały usunięte, a komórki przepłukano 1x ciepłym PBS. Komórki pobierano przez trypsynizację i zbierano do probówek stożkowych o pojemności 15 mL, w których granulowano przez 5 min 200rcf. Płyn aspirowano, granulki ponownie zawieszano w 2 mL PBS i przenoszono do probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 × 2 mL. Białka ekstrahowano do frakcji cytozolowej i jądrowej przy użyciu zestawu do ekstrakcji NE-PER (Thermo-Fisher, nr kat. 78833) zgodnie z zaleceniami producenta, dodając krótką sonifikację (10 sekund, 10 kHz) po pierwszym etapie zawiesiny jądrowej. Preparaty białkowe przechowywano w temperaturze -80C do czasu analizy Western blot.

Do obrazowania konfokalnego obrazy uzyskiwano w mikroskopie konfokalnym Zeiss Elyra PS.1 z obiektywem olejowym Plan-Apochromat 63x/1.40. Wszystkie analizy kolokalizacji zostały wykonane przy użyciu oprogramowania ImageJ (NIH) poprzez utworzenie ROI dla każdego jądra z pojedynczego obrazu znajdującego się w środku jądra w kierunku z. Wtyczka CoLoc 2 została użyta do pomiaru współczynnika Pearsona pomiędzy sygnałami i oczekiwaną wartością tła po losowej translokacji jednego kanału względem drugiego.

Mózg myszy

Mózgi samców myszy (wiek 3-6 miesięcy) zostały wycięte bezpośrednio po śmierci, umieszczone w 6 mL świeżego 4% PFA w PBS i utrwalone za pomocą Pelco Biowave Pro przez 90 minut przy 150 W w cyrkulującej łaźni wodnej. Mózgi przeniesiono do 4°C w celu dalszego utrwalania przez noc. Następnego dnia PFA zastąpiono 0,05% azydkiem sodu i przechowywano w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.

Po utrwaleniu mózgi były krojone na 50 µm koronalne lub strzałkowe pływające przekroje przy użyciu Vibratome Leica VT1000S. W przypadku niektórych przeciwciał, przed blokowaniem wymagane było zastosowanie metody Heat Induced Epitope Retrieval (HIER). Wycinek mózgu dodawano do probówki zawierającej bufor HIER (1 mM EDTA, 10 mM Tris Base, 0,05% Tween, pH = 8.5), gotowano na parze przez 20 min i chłodzono w temperaturze pokojowej przez 20 min. Tkanka była blokowana przez 1 godzinę w buforze blokującym (0,1% Triton-X, 10% surowicy koziej, w PBS). Przeciwciało pierwotne rozcieńczano w buforze inkubacyjnym (rozcieńczenie 1:5 buforu blokującego) w stężeniu zoptymalizowanym dla każdego przeciwciała i inkubowano przez noc, w ciemności, wytrząsając w temperaturze pokojowej. Tkankę płukano przez 30 min 5-krotnie PBS. Komplementarne przeciwciało drugorzędowe rozcieńczano w buforze inkubacyjnym i inkubowano podobnie przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia tkankę przemywano 5 wymianami PBS. Barwienie DAPI wykonywano tuż przed ostatnim płukaniem. Tkankę umieszczano na szkiełku podstawowym w roztworze CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution. Szkiełko nakrywkowe #1.5 zostało przyklejone do tkanki za pomocą Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Pierwotnymi stosowanymi przeciwciałami były: anty-α-Synukleina Phospho (Ser129) Antibody clone 81 A, monoklonalne mysie, rozcieńczenie 1:667, Biolegend cat#825701; anty-alfa Synuclein (phospho S129) antibody , monoklonalne królicze, rozcieńczenie 1:500, Abcam cat#ab51253; anty-asyn (Syn1/mSyn), monoklonalne mysie, rozcieńczenie 1:500 rozcieńczenie, BD Biosciences cat#610786; Anti-pan-ADP-ribose binding reagent, królik, rozcieńczenie 1:1000, Millipore cat#MABE1016; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer, clone 10 H (PADPR), kurczak, rozcieńczenie 1:100, Tulip BioLabs cat#1023; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody clone JBW301, mysz, rozcieńczenie 1:500, Millipore cat#05-636; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody clone 20E3, królik monoklonalny, rozcieńczenie 1:500, Cell Signaling cat#9718 Użyte przeciwciała drugorzędowe to: Alexa 647, kozi anty-rabbit, rozcieńczenie 1:1000, Invitrogen cat#MPA21245; Alexa 647, kozi anty-mouse, rozcieńczenie 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, kozi anty-rabbit, 1:1000 rozcieńczenie, Abcam cat#ab150078; Alexa 555, kozi anty-mouse, rozcieńczenie 1:1000, Abcam cat#ab150114; Alexa 488, kozi anty-kurczak, rozcieńczenie 1:1000, Abcam cat# ab150169.

Do obrazowania konfokalnego, obrazy uzyskano w mikroskopie konfokalnym Zeiss Elyra PS.1 z obiektywem olejowym Plan-Apochromat 63x/1,40. Moce lasera 1-5% były używane do akwizycji z-stacków przez 2-4 regiony kory na sekcję tkanki. Oprogramowanie do obrazowania Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) zostało użyte do analizy danych IHC. W celu odseparowania jądra od cytoplazmy, utworzono powierzchnię przy użyciu kanału DAPI. Analizowano tylko całe jądra neuronów. Informacje statystyczne (średnia intensywność, suma intensywności, całkowita liczba powierzchni) dla każdego kanału zostały wyeksportowane i poddane dalszej analizie w programie Prism 6 (GraphPad). W celu analizy ognisk w jądrach, sygnał jądrowy wybranego kanału był maskowany przy użyciu powierzchni jądrowej utworzonej z kanału DAPI. Z sygnału jądrowego wybranego zamaskowanego kanału utworzono powierzchnie do ilościowej oceny ognisk jądrowych.

Mózg ludzki

Sekcje z jądra migdałowatego z ludzkich przypadków demencji z ciałami Lewy’ego pobrano natychmiast po autopsji (okres pośmiertny 12-48 godzin), umieszczono w 6 mL świeżego 4% PFA w PBS i utrwalono za pomocą Pelco Biowave Pro przez 90 minut przy 150 W w cyrkulującej łaźni wodnej. Sekcje przeniesiono do 4 °C w celu dalszego utrwalania przez noc. Następnego dnia PFA zastąpiono 0,05% azydkiem sodu i przechowywano w temperaturze 4 °C do dalszego przetwarzania.

Po utrwaleniu, sekcje migdałka zostały pocięte na 50 µm pływające sekcje przy użyciu Vibratome Leica VT1000S. Tkanka była blokowana przez 1 godzinę w buforze blokującym (0,1% Triton-X, 10% surowicy koziej, w PBS). Przeciwciało pierwotne rozcieńczano w buforze inkubacyjnym (rozcieńczenie 1:5 buforu blokującego) w stężeniu zoptymalizowanym dla każdego przeciwciała (patrz poniżej) i inkubowano przez noc, w ciemności, wytrząsając w temperaturze pokojowej. Tkankę płukano przez 60 min 5-krotnie PBS. Komplementarne przeciwciało drugorzędowe rozcieńczano w buforze inkubacyjnym i inkubowano podobnie przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia tkankę przemywano 5 wymianami PBS. Barwienie DAPI wykonywano tuż przed ostatnim płukaniem. Tkankę umieszczano na szkiełku podstawowym w roztworze CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution. Szkiełko nakrywkowe #1,5 przyklejono do tkanki za pomocą Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Pierwotnymi przeciwciałami były: anti-α-Synuclein Phospho (Ser129) Antibody clone 81 A, monoklonalne mysie, rozcieńczenie 1:667, Biolegend cat#825701; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody clone 20E3, monoklonalne królicze, rozcieńczenie 1:500, Cell Signaling cat#9718. Użyto przeciwciał drugorzędowych: Alexa 647, kozi anty-mysi, rozcieńczenie 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 488, kozi anty-rabbit, rozcieńczenie 1:1000, Abcam cat#ab150077.

Obrazy były rejestrowane na mikroskopie Zeiss LSM 880 z Airyscan. Aby określić specyficzne sygnały przeciwciał z podwyższonego autofluorescencyjnego barwienia tła w próbkach tkanek ludzkich, zastosowano liniowy protokół niemieszania. Tryb Lambda został użyty do ustawienia parametrów dla obiektywu, laserów i dichroików wymaganych do obrazowania wielokolorowej próbki. Używając tych samych parametrów, stworzono indywidualne widma referencyjne z jednobarwnych wybarwionych próbek. Dodatkowo, nie wybarwiona próbka została użyta do określenia widm referencyjnych tła. Wszystkie pozostałości zostały zminimalizowane podczas tworzenia widm referencyjnych. Próbka wielobarwna była następnie obrazowana, z określeniem odpowiednich widm tła i widm jednobarwnych, i odmiksowana przy użyciu oprogramowania Zeiss Zen.

Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) został użyty do analizy danych IHC. W celu wyodrębnienia jądra z cytoplazmy, utworzono powierzchnię przy użyciu kanału DAPI. Analizie poddawano tylko całe jądra neuronów. Informacje statystyczne (średnia intensywność, suma intensywności, całkowita liczba powierzchni) dla każdego kanału były eksportowane i dalej analizowane w Prism 6 (GraphPad). W celu analizy ognisk w jądrach, sygnał jądrowy wybranego kanału był maskowany przy użyciu powierzchni jądrowej utworzonej z kanału DAPI. Z sygnału jądrowego wybranego kanału maskowano powierzchnie w celu ilościowego określenia ognisk jądrowych.

HAP1 cell comet assay

HAP1 cell neutral comet assays were performed according to Trevigen’s recommendations (Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K). Zawiesiny komórek (2 × 104 komórki/ml) w IMDM bez surowicy (Sigma) zmieszane w stosunku 1:2 z Comet LMAgarose (Trevigen) nanoszono pipetą na CometSlidesTM (Trevigen) i umieszczano w temperaturze 4 °C na 10-15 minut w celu odlania. Szkiełka były inkubowane przez noc w roztworze do lizy (Trevigen) w temperaturze 4 °C w ciemności, a następnie w obojętnym buforze do elektroforezy (300 mM octanu sodu, 100 mM Tris-HCl, pH 9) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności. Diapozytywy poddawano elektroforezie w świeżym buforze przez 40 min przy napięciu 20 V (1 V/cm) w 4 °C. Po elektroforezie szkiełka inkubowano najpierw w buforze do wytrącania DNA (1 M octan amonu, 86,6% EtOH), a następnie 70% EtOH w temperaturze pokojowej w ciemności, przez 30 min każdy i suszono w temperaturze 37 C. Szkiełka barwiono 1X SYBRTMgreen (Invirogen) w 1X PBS (Gibco) w temperaturze pokojowej przez 30 min w ciemności, zanurzano w dH2O 10 razy, aby zmyć nadmiar barwnika i suszono w temperaturze 37 C. Komety były wizualizowane na aparacie Zeiss Apotome przy użyciu obiektywu 10X i oceniane przy użyciu CometScoreTM.

Test Cometowy po traktowaniu bleomycyną: Jeden dzień przed leczeniem komórki Hap1 WT i Hap1 SNCA KO były wysiewane na płytki 2 × 35 mm na warunek, aby następnego dnia były ~80% konfluentne. Protokoły traktowania Bleomycyną i Sham były wykonywane tak samo jak dla ICC. Po leczeniu, media zostały usunięte, a komórki przepłukano 1x ciepłym PBS. Jeśli następował okres regeneracji, wtedy dodawano świeżą, ciepłą pożywkę i komórki umieszczano z powrotem w inkubatorze. Komórki były zbierane przez trypsynizację przy użyciu 0,05% Tripsin-EDTA (Gibco nr kat. 15400-54). Trypsynizowane komórki z płytek 2 × 35 mm zbierano do probówek stożkowych o pojemności 15 mL i granulowano przez 5 min 200rcf. Płyn aspirowano, granulki zawieszano ponownie w 250uL świeżej pożywki bez FBS lub Penn-Strep, przenoszono do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 mL i przechowywano na lodzie do czasu użycia w teście Comet Assay, jak opisano powyżej.

Atest kometowy tkanki mózgowej myszy

Świeżo pobrana tkanka mózgowa od samców myszy (w wieku 1, 3, 6-9 miesięcy) została drobno posiekana żyletką i zawieszona w lodowato zimnym PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i homogenizowana przez 30 sekund przy użyciu ręcznego homogenizatora. Tkanka była mikrowirowana przez jedną minutę, a supernatant rozcieńczany w stosunku 1:10 w PBS. Komórki liczono za pomocą hemocytometru i rozcieńczano do 1 × 105/ml. Rozcieńczone komórki łączono z niskotopliwą (LM) agarozą w stosunku 1:2 (v/v) i rozprowadzano w studzience szklanego szkiełka kometowego (Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K). Szkiełka suszono w ciemności w temperaturze 4 °C przez 15 minut i umieszczano w roztworze lizującym zestawu w temperaturze 4 °C przez noc. Nadmiar buforu odsączano ze szkiełek przed zanurzeniem w 50 mL TBE, pH 7,4, na 30 min w temp. 4 °C. Szkiełka poddano elektroforezie w TBE, pH 7,4, przy napięciu 20 V przez 40 minut w 4 °C. Nadmiar TBE odsączano, a szkiełka umieszczano dwukrotnie w dH2O na 5 min. Następnie szkiełka umieszczano w 70% EtOH na 5 min i suszono w temp. 37 °C przez 15 min. 100 µl 1X SYBR-Green nanoszono pipetą na każdy krąg wysuszonej agarozy i próbki barwiono przez 30 min w temp. pokojowej w ciemności. Nadmiar roztworu SYBR-Green usunięto, a szkiełka kilkakrotnie przepłukano w dH2O. Szkiełka pozostawiano do całkowitego wyschnięcia w temperaturze 37 °C i przechowywano w temperaturze 4 °C. Komety były wizualizowane w mikroskopie Zeiss ApoTome pod obiektywem 10X i oceniane przy użyciu oprogramowania CometScore™ (TriTek).

Electrophoretic mobility shift assay

Przygotowanie DNA

Fragmenty o długości 300 bp były ekstrahowane z drabinki 100 bp (NEB) rozdzielane na 1% żelu agarozowym przy 175 V przez 2 godziny w RT przy użyciu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). DNA zostało oczyszczone przy użyciu zestawu DNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research) i eluowane w 1X TE. Końcowe stężenie i czystość DNA oznaczono za pomocą Nanodrop.

Electrophoretic mobility shift assay

Fragmenty DNA (20 ng) mieszano z rekombinowanym hu_ser129_phospho-syn (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg i 16 µg; Proteos, Inc.), rekombinowaną hu_α-synukleinę (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg i 16 µg; Proteos, Inc.) lub rekombinowaną S-transferazę glutationową (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg i 16 µg; GenScript) w 20 μL reakcji zawierającej 94 mM Tris-Cl, pH 8,0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA i 5% fikollu w lodzie przez 20 min, a następnie w temperaturze pokojowej przez 30 min. Po dodaniu 2 µL 10X Orange Loading Buffer (Licor), 8 μL całej reakcji ładowano do 10% lub 6% żelu poliakrylamidowego TBE (Novex) i prowadzono przy napięciu 100 V przez 2 godz. w RT. Żele barwiono przez 30 minut 10X SYBRTM Safe DNA Stain (Invitrogen) w 1X TBE. Obrazy uzyskano przy użyciu systemu obrazowania Fluorchem M i oceniono ilościowo przy użyciu narzędzia ImageJ Gel Analyzing.

Western blot

10% żele poliakrylamidowe TBE przenoszono na Biodyne™ B Nylon Membrane (Thermofisher Scientific) przy napięciu 30 V przez 1 godzinę i 16 minut na lodzie w 0.5X TBE przy użyciu Novex XCell II Blotting System (Invitrogen). Membrany blokowano przez noc w Odyssey PBS Blocking Buffer (Li-Cor) i barwiono przez 1 godzinę przy RT z Syn1 (1:1,000; Biolegend) i przez noc w 4 °C z IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG (1:10,000; Li-Cor). Obrazy uzyskano przy użyciu Li-Cor Odyssey CLx Imaging System.

Western Blot for Hap1 Nuclear protein preps: Stężenia cytoplazmatycznych i jądrowych preparatów białkowych Hap1 NE-PER zostały określone ilościowo przy użyciu zestawu Pierce BCA Protein Assay (Pierce, nr kat. 23225) i odczytane na mikropłytkowym fotometrze Multiskan FC (Fisher, nr kat. 51119000) z odczytem 550 nm. 5 µg & 10 µg białka jądrowego rozcieńczano w SDS sample buffer (Novex, kat. LC2676) + BME (Gibco, kat. 21985-023) i ładowano na żel 10-20% Tris-Glycine (Novex, kat. XP10202BOX). W celach referencyjnych załadowano 3 µL wstępnie wybarwionej kolorowej drabinki białkowej (NEB, nr kat. P7719). Żel był prowadzony przy użyciu Novex Xcell Blotting System w buforze SDS (Novex, nr kat. LC2675) przez 70 min przy 120 V. Żel był rozkładany i przygotowywany do transferu na membranę Immobilon-FL PVDF (Millipore, nr kat. IPF00010). Żel przenoszono w buforze transferowym Tris-Glicyna (Novex, nr kat. LC3675) na lodzie przez 2 godz. pod napięciem 25 V. Po transferze, membrana była usuwana i natychmiast utrwalana w 4% PFA + 0.01% Glutaraldehydzie przez 10 minut z delikatnym wstrząsaniem w RT. Membranę płukano 1x w milliQ H2O i barwiono zestawem do barwienia białka całkowitego REVERT (LI-COR, nr kat. 926-11010) zgodnie z protokołem producenta. Barwienie całkowitego białka uzyskano przy użyciu urządzenia LI-COR Odyssey CLx Imager. Po odwróceniu barwienia REVERT, membranę przemywano 1x w milliQ H2O i blokowano w Odyssey Blocking Buffer (LI-COR, nr kat. 927-40000) przez noc w temperaturze 4 C przy delikatnym wstrząsaniu. Przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczano w stosunku 1:1000 w Blocking Buffer i inkubowano przez 2 godz. w RT przy delikatnym wstrząsaniu. Membranę płukano 3x w 0,1% Tween20 w PBS przez 10 min. Przeciwciała drugorzędowe (LI-COR IR680LT donkey anti-rabbit cat. 926-68023; IR800CW donkey anti-mouse cat. 926-32212) rozcieńczono w stosunku 1:10000 w buforze blokującym i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze RT z delikatnym wstrząsaniem. Membranę płukano 3x w 0,1% Tween20 w PBS przez 10 min i 1x w PBS przez 10 min, w temperaturze RT. Obrazy były pozyskiwane przy użyciu LI-COR Odyssey CLx Imager. Analizę przeprowadzono na FIJI przy użyciu analizatora żelu. Sygnał przeciwciał normalizowano do białka całkowitego REVERT.

T4 ligase-mediated DNA end-joining assay

Każda reakcja end-joining zawiera 150 ng produktu PCR 1,2 kb DNA trawionego na końcach 5′ i 3′ enzymem restrykcyjnym XhoI (NEB RO146S). Reakcje przeprowadza się w 20 µL objętości reakcyjnej zawierającej 150 ng strawionego DNA, 2,8 µL buforu białkowego (10 mM Tris, 50 mM NaCl pH = 7,6), 5,3 µL 20% glicerolu w PBS + Mg + Ca, 2 µL buforu ligazy T4, 200 ng lub 40,5 ng białka, 25U ligazy T4 (NEB M0202) oraz sterylną H2O do objętości. Wszystkie składniki oprócz ligazy T4 łączono i inkubowano na lodzie przez 15 min. Do reakcji dodawano 25U ligazy T4 i inkubowano w RT przez 90 min. Po inkubacji, reakcję natychmiast oczyszczano za pomocą kolumny Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research) i eluowano w 15 µL sterylnej H2O. Do DNA dodawano SybrGreen i bufor ładujący, a próbki poddawano elektroforezie w 1% żelu agarozowym TAE przez 1 godz. przy 135 V i obrazowano na wywoływarce chemiluminescencji i fluorescencji Syngene G:BOX. Do analizy obrazu żelu użyto programu ImageJ, a dane przedstawiono za pomocą programu Prism 6 (GraphPad).

Projekt eksperymentalny & Analiza statystyczna

Wszystkie wartości ilościowe podano jako średnią ± SEM. Odpowiedni typ i liczba próbek (N) oraz testy statystyczne stosowane do oceny istotności dla każdego eksperymentu są przedstawione przy każdym zestawie danych. Wielkości prób stosowane w każdym eksperymencie były oparte na szacunkach oczekiwanych wielkości efektu (~10-50%) i standardowych odchyleń z danych wstępnych i były zasilane w celu wykrycia różnic przy poziomie istotności 0,05 (α) i mocy 0,9 (1-β).