Jednym z najtrwalszych wkładów Winthropa do kolonii w Zatoce Massachusetts było jego silne oparcie się na religii. Będąc jeszcze na pokładzie Arbelli, Winthrop i inni założyciele wyłożyli swoje religijne nadzieje dla nowej kolonii w dokumencie zwanym „Model of Christian Charity”. Wyłożył w nim, jak purytanie mieliby zachować czystość, aby Bóg nadal błogosławił kolonistom w oczekiwaniu na ich szansę powrotu i uratowania Anglii przed wiecznym ogniem piekielnym. Odrzucił Kościół Anglii, jego hierarchię i jego ceremonie. W celu zachowania świętości nowej kolonii, dyscyplina stała się jednym z największych problemów wśród grupy religijnej, z których większość była prowadzona na poziomie rodzinnym. W rzeczywistości dyscyplina rodzinna stała się tak ważna, że kolonia zabroniła komukolwiek mieszkać samemu, a samotni mężczyźni i kobiety musieli zamieszkać z innymi rodzinami. Sprawy, które były zbyt duże, aby rodzina mogła je kontrolować – te, które miały wpływ na całą społeczność – trafiały przed Sąd Generalny, gdzie bogobojna kolonia cierpiała z powodu wpływu diabła. Winthrop pieczołowicie zapisywał w swoim dzienniku przewinienia swoich współkolonistów. Odpłata była zawsze szybka i surowa. Na przykład w jednym z bardziej dziwacznych przypadków George Spencer został stracony po tym, jak jedna z jego świń spłodziła prosię o ludzkich podobieństwach. Świętym” nowej kolonii łatwo było wydawać surowe wyroki na grzeszników, ponieważ wiedzieli, że sąd Boży będzie równie szybki. Jeśli kościół i Bóg były częścią codziennego życia w Anglii, osadnicy celowo uczynili je całym swoim życiem w Nowym Świecie.
Pierwszy kościół w Massachusetts, kościół kongregacyjny w Salem, został założony rok przed przybyciem partii Winthropa. Do roku 1635 istniało ponad tuzin kościołów rozrzuconych po całym obszarze. Proces przyłączenia się do kościoła był rygorystyczny, ponieważ członkowie musieli zgłosić się do pastora i wyjaśnić swoją konwersję. Winthrop wierzył jednak, że większość ludzi, którzy wyruszyli w podróż do Nowego Świata, udowodniła już swoje oddanie Bogu, szukając czystego środowiska.
Wiara purytan silnie wierzyła w siłę jednostki i stroniła od hierarchii bardziej ustabilizowanych kościołów, takich jak Kościół Anglii i Kościół rzymskokatolicki.Problem z tą wiarą polegał jednak na tym, że kościół purytański nie miał określonej ortodoksji ani kontroli nad tym, czego nauczały poszczególne kościoły – niedopatrzenie, które spowodowało kilka poważnych kryzysów w nowej kolonii.
W 1631 roku George Phillips, pastor kościoła w Watertown, zaczął nauczać swoich wiernych, że zarówno Kościół Anglii, jak i Kościół katolicki były „prawdziwymi” kościołami – przeciwieństwem tego, co wyznawali purytanie, a mianowicie, że oba były zbyt zepsute dla Boga. Winthrop udał się do Watertown, aby debatować z pastorem przed zgromadzeniem. Pod koniec nocy wszyscy członkowie kościoła z wyjątkiem trzech przyznali, że nauki Phillipsa i ich przekonania były w błędzie.
Poważniejszy kryzys dotyczył dobrze mówiącego i czarującego kaznodziei Rogera Williamsa. Problem z tworzeniem kolonii w celu przyciągnięcia religijnych separatystów polegał na tym, że często nie bali się oni występować przeciwko rządowi i ustalonym stanowiskom kościoła, nawet tak separatystycznego kościoła jak sam kościół purytański.Williams był zaangażowany w projekt Zatoki Massachusetts od jego najwcześniejszych dni, uczestnicząc nawet w pierwszym spotkaniu w 1629 roku. Kiedy Williams przybył za granicę Lyonu w środku pierwszej zimy, Winthrop okrzyknął przybycie „boskiego ministra”. Następnie Williams został zaproszony do zostania pastorem kościoła w Bostonie, ale odmówił, wierząc, że kościół w Bostonie był dla niego zbyt nieczysty, ponieważ nie wszyscy w kościele potępili Kościół anglikański.Winthrop ostro skrytykował Williamsa, nazywając jego poglądy wrongand hinting, że użyje swojego autorytetu, aby utrzymać kościół od negocjacji, aby uzyskać Williams. Williams odszedł do Salem, ale nie przedthreatening że Winthrop władza cywilna nie może interweniować w sprawach kościelnych. Kościół w Salem, prowadzony przez Johna Endecotta, powitał go z otwartymi ramionami, aż Winthrop napisał do Endecotta „zdumiewając się”, że miasto zaakceptuje tak niebezpiecznego ministra. Williams osiedlił się w końcu w Plymouth, poza strefą wpływów Winthropa. Nie był tam jednak długo zadowolony.
W 1633 roku gubernator Plymouth John Bradford skomentował, że William zaczął wyrażać i praktykować „dziwne opinie”, co ostatecznie doprowadziło do opuszczenia kościoła przez kaznodzieję. Jego skarga dotyczyła tego, że kiedy mieszkańcy Plymouth wrócą do Anglii, będą uczestniczyć w anglikańskich nabożeństwach, zanieczyszczając w ten sposób kościół w Plymouth po powrocie. Williams wrócił do Salem, gdzie ludzie mianowali go asystentem pastora, a on natychmiast wyruszył, by oczyścić kościół w Salem.
Winthrop i inni przywódcy kolonialni zaczęli go wypytywać o oświadczenie, które złożył w Plymouth, a które potwierdzało, że koloniści nie mieli prawa do ziemi, którą zajmowali. Williams stwierdził, że król rządził „uroczystym publicznym kłamstwem” i nie miał prawa przyznawać ziemi kolonii. Sąd niezwłocznie nakazał Williamsowi stawić się na następnym posiedzeniu, aby zostać ocenzurowanym.Winthrop próbował zminimalizować konfrontację i napisał do Williamsa, wskazując mu sposoby na zakwalifikowanie jego oświadczeń do sądu.Williams zachowywał się zadowalająco dla sądu i nic więcej nie zostało powiedziane o tym incydencie.
Jednakże w listopadzie 1634 roku, sześć miesięcy po tym, jak Winthrop został usunięty jako gubernator, do sądu dotarły wieści, że Williams ponownie zaczął głoszenie swoich przekonań. Mówił osadnikom, że statut musi być napisany na nowo, albo że cała kolonia będzie musiała zostać rozwiązana, aby ją „oczyścić”. Kiedy Sąd Generalny odwołał Williamsa, ministrowie z okolicy poprosili, aby zamiast tego poradzić się przestępcy prywatnie – co zapobiegło wysłaniu przez Williamsa zredagowanego listu do króla, oskarżającego go o kłamstwo. W ciągu następnego roku Williams był wielokrotnie wzywany do stawienia się przed sądem, za każdym razem po naruszeniu obyczajów purytanów. Kary nie miały jednak większego wpływu na jego kongregację i wiosną 1635 roku kościół w Salem mianował go pełnym pastorem.
Sąd Generalny i inni ministrowie zareagowali stanowczo.Podczas gdy kościoły nie były w stanie podjąć działań przeciwko Salem, aby zapobiec naukom Williamsa, rząd cywilny nie miał takich skrupułów.Salem poprosiło o więcej ziemi na pobliskim półwyspie, a Sąd Generalny ogłosił, że miasto może otrzymać tę ziemię tylko wtedy, gdy usunie Williamsa z jego stanowiska – posunięcie, które rozgniewało mieszkańców Salem. Zwrócili się oni o pomoc do innych kościołów w okolicy, ale ich apele pozostały bez echa. Jak sąd zrobił bitwę przeciwko Salem, cała kolonia mogłaby się załamać, gdyby Williams nie był zamknięty w domu z powodu choroby; mógł komunikować się tylko przez listy, a więc jego urok został utracony zarówno na Salem, jak i sądu. Poprosił mieszkańców Salem, aby wyrzekli się wszystkich innych kościołów i ogłosili się jedynym „prawdziwym” kościołem – było to niebezpieczne i izolujące posunięcie. Salem odmówiło.
W ostatecznej konfrontacji Sąd Generalny wezwał Williama do stawienia się w październiku 1635 roku, gdzie nakazał mu opuszczenie kolonii w ciągu sześciu tygodni. Później przedłużył ten termin do następnej wiosny, ale w styczniu 1636 roku Williams opuścił Zatokę Massachusetts wraz z grupą zwolenników i udał się do Zatoki Narragansett w pobliskim Rhode Island.
Na razie kościół purytański i ich zbiór wierzeń były bezpieczne. Winthrop zręcznie poradził sobie z największym kryzysem stojącym przed nową kolonią i po raz kolejny uratował ją przed możliwą ruiną.