Alfa-sinucleina este o proteină de legare a ADN-ului care modulează repararea ADN-ului cu implicații pentru tulburările cu corpuri Lewy

Oameni

Tesutul subiecților umani a fost obținut prin intermediul Oregon Alzheimer’s Disease Center (ADC) și OHSU Department of Pathology, iar subiecții afectați aveau diagnosticul clinic și patologic stabilit (demență cu corpuri Lewy). Utilizarea țesuturilor a fost aprobată de IRB de la OHSU și a fost efectuată în conformitate cu orientările relevante. Consimțământul în cunoștință de cauză a fost obținut de la toți participanții și/sau de la reprezentanții legali ai acestora.

Animale

Animalele au fost adăpostite de Departamentul de Medicină Comparată al OHSU într-un vivariu cu ciclu lumină-întuneric și cu temperatura și umiditatea controlate și au fost întreținute cu hrană și apă ad libitum. Toate experimentele au fost aprobate de OHSU IACUC, toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările relevante și s-au depus toate eforturile pentru a minimiza numărul de animale utilizate și suferința acestora.

Generarea modelului de șoarece

Liniile de șoareci transgenici

Utilizând OHSU Transgenic Mouse Model Core, am creat un șoarece care exprimă alfa-sinucleina umană fuzionată cu GFP îmbunătățită (etichetă C-terminală) care conține o mutație punctiformă la Alanina 53 (GCA > ACA) care cauzează o modificare a aminoacidului treonină (A53T Syn-GFP). Secvența A53T-Syn-GFP a fost clonată în vectorul MoPrp.Xho (cadou de la David Borchelt)74 în situl XhoI. Expresia se află sub controlul transcripțional al promotorului proteinei prionice de șoarece. Secvența de legătură de 30 pb dintre A53T Syn și GFP este GGTACCGCGCGGGCCCCCGGGATCCATCGCCACC, care se traduce prin GlyThrAlaGlyProGlySerIleAlaThr. Această linie de șoareci prezintă expresia A53T Syn-GFP în >90% din neuronii corticali și <10% din astrocite (A.J.S. și V.K.U., date nepublicate). Șoarecii transgenici 142E Syn-GFP32,33,39,75 și liniile de șoareci 142E Syn-GFP/șoarece mSynKO au fost obținute de la creatorii liniei, Edward Rockenstein și Eliezer Masliah. Șoarecii transgenici TdTomato-NLS cu localizare nucleară au fost obținuți de la Jackson Laboratories (nr. de stoc 023035). Animalele knock-out pentru alfa-sinucleină și șoarecii de control corespunzători au fost obținuți de la Jackson Laboratories (nr. de stoc 016123, 005304).

Generarea virusului AAV8

Am creat construcții virale de A53T Syn-GFP care conțin mutații punctiforme în alfa-sinucleină la serina-129 care cauzează fie o modificare a aminoacizilor cu alanină (TCT > GCT), fie cu acid aspartic (TCT > GAT) (construcții oferite de Pamela McLean). Aceste construcții au fost clonate în vectorul viral autocomplementar AAV8 pTRS-KS/CBh-GFP (de la National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, IN), sub controlul transcripțional al promotorului CBh (Chicken Beta Actin Short), utilizând situsurile enzimatice de restricție AgeI și ApaI. Secvența de legătură de 30 bp dintre alfa-Syn & GFP îmbunătățită este GGTACCGCGGGGGCCCGGGATCCATCGCCACC. Virusurile finale scAAV8-CBh-A53T-S53T-S129A-Syn-GFP și scAAV8-CBh-A53T-S129D-Syn-GFP au fost realizate de către Gene Transfer Vector Core de la Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Boston, MA.

Injecțiile intraventriculare virale AAV8

Injecțiile virale AAV8 intraventriculare în nou-născuții P0 au fost realizate în conformitate cu protocolul de mână liberă76. Am injectat 2 µL de virus nediluat în fiecare ventricul lateral la titruri ~1E12 copii genomice pe mililitru. Singura abatere de la acest protocol publicat este că nu am diluat virusul în albastru trypan.

Inducția patologiei Lewy la șoareci

Soarecii masculi de 2 până la 3 luni au fost injectați cu PFF de secvență WT de șoarece în conformitate cu protocoalele noastre publicate anterior25. 2,5 μl (2 mg/ml) de PFFs proaspăt sonicate sau 2,5 μl de PBS au fost injectate în cortexul senzorial-motor primar al emisferei drepte la animale anesteziate cu izofluran (1 % până la 2 %) și returnate în cușca lor de origine. Acestea au fost sacrificate și pregătite pentru IHC, așa cum este descris mai jos, după un interval post-injecție de 3-6 luni (6-9 luni).

Imagistică in vivo a creierului de șoarece & analiză

Chirurgia ferestrei craniene și imagistica au fost realizate folosind același protocol pe care l-am publicat anterior25,39 la animale anesteziate cu izofluran, folosind un microscop multifotonic Zeiss LSM 7MP echipat cu detectori BiG (GaAsP binar) cu două canale și o sursă laser cu impulsuri de femtosecunde Coherent Technologies Chameleon titanium-sapphire (reglat la 860 nm pentru imagistica Syn-GFP). S-a utilizat software-ul de achiziție a imaginilor Zeiss Zen 2011. Pentru experimentele de deteriorare indusă de laser (LID) a nucleului, funcția Bleaching din Zen a fost utilizată pentru a ilumina regiuni mici, de dimensiuni submicronice în interiorul nucleului cu laserul Chameleon acordat la ~730 nm pentru <1 ms). Este necesară o întârziere de ~4 sec pentru a comuta laserul la și de la lungimea de undă LID (~730 nm). Într-un subset de experimente, au fost generate animale care au exprimat Syn-GFP simultan cu TdTomato-NLS localizat nuclear. Acestea au demonstrat că localizarea impulsului LID în regiunile >2 μm de la periferia celulei au fost întotdeauna poziționate în interiorul nucleului. Acest criteriu a fost utilizat pentru a localiza pulsul LID în interiorul nucleelor neuronilor corticali care exprimă Syn-GFP in vivo. Imaginile LID au fost analizate cu ImageJ în mod similar cu experimentele noastre FRAP descrise anterior25,39. Regiunile de interes (ROI) au fost selectate pentru a obține valorile medii ale fluorescenței în LID și în ROI-urile de control din nucleu. Raportul dintre semnalul la fiecare punct de timp din LID și din ROI-urile de control a fost utilizat pentru a calcula Raportul de îmbogățire. Pentru experimentele FRAP după LID, a fost utilizat un protocol de fotobleaching și de analiză similar cu cel publicat anterior în lucrările noastre25,39. Datele au fost analizate în Prism 6 (GraphPad) pentru a obține ajustări exponențiale simple pentru evoluția timpului de recuperare și pentru fracțiile imobile și mobile. Toate animalele utilizate au avut între 5 și 9 luni.

Culturi de neuroni corticali de șoarece și imagistică

Soarecii C57/BL6 au fost utilizați pentru a genera culturi neuronale primare izolate de la șoareci embrionari, pe baza metodelor lui Kaech și Banker77 și adaptate de Gray și colegii săi78. Pe scurt, embrionii au fost recoltați la 18 zile de gestație de la femele anesteziate. Cortexul a fost disecat, ușor tocat și tripsinizat pentru a genera suspensii de neuroni dispersați. Neuronii corticali proaspăt izolați au fost electroporați cu plasmide care codifică două construcții de alfa-sinucleină umană marcate cu o GFP îmbunătățită (scAAV-huSyn_s129A:EGFP, scAAV-hySyn_s129D:EGFP). 330.000 de neuroni corticali electrocutați de la fiecare construcție au fost plasați pe farfurii care conțin acoperitoare acoperite cu poli-L-lizină în mediu MEM (GIBCO/Life Technologies), 5% FBS (Atlanta Biologicals) și 0,6% glucoză (Sigma-Aldrich). După 4 ore, mediul a fost îndepărtat și înlocuit cu mediu Neurobasal suplimentat cu 1 × GlutaMAX (GIBCO/Life Technologies) și 1 × GS21 (MTI-GlobalStem). Fiecare farfurie a fost hrănită în fiecare săptămână cu 0,5 ml de mediu Neurobasal plus GlutaMAX și GS21, prima hrănire (la 5 zile in vitro (DIV)) conținând AraC. După 7 DIV, au fost imaginate coverslipi de la neuronii cultivați din fiecare construcție cu ajutorul unui sistem de celule vii cu o cameră de imagistică închisă. Experimentele LID nucleare de cultură celulară au fost efectuate pe aceeași platformă de imagistică, utilizând aceleași protocoale de imagistică și analiză ca și experimentele noastre LID nucleare in vivo descrise mai sus.

Culturi hipocampale de șoarece & Însămânțarea cu PFF

Culturile hipocampale de șoarece și formarea patologiei Lewy induse de însămânțarea cu PFF au fost efectuate utilizând tehnicile noastre descrise anterior79,80. Pe scurt, culturile neuronale primare au fost pregătite din creiere de șoarece E16-E18 CD1 (Charles River). Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor experimentale și au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Pennsylvania. Neuronii hipocampali disociați au fost plasați pe acoperitoare acoperite cu poli-D-lizină (Carolina Biological Supply) la o densitate de ~50.000 de celule/cm2. PFF-urile de alfa-sinucleină umană recombinantă purtând mutația patogenă S87N81 au fost diluate în PBS la 0,1 mg/mL, sonicate și diluate în mediul neuronal. Neuronii au fost tratați la 5 ug/ml la DIV 7 și au fost incubați timp de 12 zile. Celulele au fost fixate în 4% PFA/4% zaharoză timp de 15 minute la temperatura camerei, apoi au fost permeabilizate în 0,3% Tx-100 și blocate timp de 1 oră la temperatura camerei în 3% FBS/3% BSA. Anticorpii primari (anti-α-Synuclein PhosphoSer129 clona 81 A, diluție 1:2000, Biolegend cat#825701; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) clona JBW301, diluție 1:500, Millipore cat#05-636) au fost diluați în tamponul de blocare și incubați la temperatura camerei timp de 3 ore. Copertinele au fost apoi spălate cu PBS de 3 ori și incubate cu anticorpii secundari marcați cu Alexa-fluor corespunzători. Copertinele spălate au fost montate pe lamele folosind Fluoromount-G cu DAPI (Fisher Scientific).

Anticorpii secundari: Alexa 488, capră anti IgG2a de șoarece, diluție 1:1000, Fisher Scientific; Alexa 594, capră anti IgG1 de șoarece, diluție 1:1000, Fisher Scientific.

Pentru vizualizarea capacelor s-a folosit un scaner PE lamina. Software-ul HALO (Indica Labs) a fost utilizat pentru a număra focarele γH2AX și nucleii colorați cu DAPI localizați la 1,5 mm de la marginea fiecărui capac. Analiza statistică a datelor a fost efectuată cu ajutorul Graphpad Prism versiunea 4.

Analiză de imunofluorescență & analiză

Celule Hap1

Liniile celulare parentale de control WT Hap1 (articol #C631 lot 29663) și Hap1 Human SNCA 103 bp deletion knockout (articol #HZGHC003210c003 lot 2) au fost obținute de la Horizon Discovery și cultivate în mediu IMDM (Gibco# 11995-065) + 10% ser fetal bovin 10% + Pen-Strep și au crescut într-un incubator umidificat la 37 C cu 5% CO2. Celulele au fost însămânțate pe coverlips nr. 1,5 acoperite cu PLL în farfurii de 35 mm cu o zi înainte de fixare și au crescut până la o confluență de ~80%. Celulele au fost fixate în PFA 4% în PBS timp de 10 minute la temperatura camerei (RT), spălate 1 dată în PBS și depozitate la 4 C în PBS până la procedura de colorare. Celulele fixate au fost permeabilizate cu 1 ml de PBS + 0,25 % Triton-X 100, agitându-se ușor la RT timp de 20 de minute. Soluția a fost îndepărtată și celulele au fost blocate timp de 20 de minute în 1 ml de tampon de blocare (0,1% Triton-X 100 10% ser normal de capră în PBS). Anticorpii primari au fost diluați în tamponul de incubare (diluție 1:5 din tamponul de blocare în PBS) și au fost incubați peste noapte la temperatura de repaus cu agitare ușoară. În ziua următoare, celulele au fost spălate de 3 ori în PBS timp de 15 minute. Anticorpii secundari complementari marcați fluorescent au fost diluați la 1:1000 în soluție tampon de incubare, adăugați la celule și incubați la temperatura de repaus, la întuneric, peste noapte, cu agitare ușoară. În ziua următoare, celulele au fost spălate de 3 ori în PBS timp de 20 de minute. Colorația nucleară a fost efectuată chiar înainte de spălarea finală în PBS cu 2,5ug/mL DAPI (Sigma D9542) în PBS timp de 20 de minute. Înainte de montare, celulele au fost spălate pentru scurt timp în H2O deionizată. Copertinele au fost montate cu 13 µL de soluție antifadică CitiFluor CFMR2 și sigilate cu Biotium CoverGrip Coverslip Sealant. Lamele au fost imaginate pe un microscop confocal cu scanare laser Zeiss Elyra PS.1 710 cu software Zen. Stivele Z cu pași de 0,5 µm au fost achiziționate cu un zoom1 de 63x, având grijă să nu se satureze niciodată semnalul anticorpilor în interiorul nucleului.

Anticorpii principali utilizați au fost: anti-Syn1, diluție 1:500, monoclonal de șoarece, BD Biosciences, cat. 610786; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer clona 10 H, diluție 1:500, policlonal de pui, Tulip BioLabs, cat. 1023; anti-Phospho-Histone H2A.X, diluție 1:500, monoclonal de iepure, Cell Signaling, cat. 9718; anti-phosphoS129-Syn EP1536Y, diluție 1:500, monoclonal de iepure, Abcam, ab51253; anti-phosphoS129-Syn 81 A, monoclonal de șoarece, diluție 1:667diluție 1:667, Covance, cat. 825701; anti-Syn 4B12, diluție 1:500, monoclonal de șoarece, Biolegend, cat. 807804; și anti-Syn EPR20535, diluție 1:100, monoclonal de iepure, Abcam, ab212184. Anticorpii secundari utilizați au fost: Alexa Fluor 647 capră anti-rabbit, ThermoFisher cat.A-21245; Alexa Fluor 555 capră anti-șoarece, Abcam ab150114; Alexa Fluor 488 măgar anti-pui, Jackson ImmunoResearch cat.703-545-155.

Tratament cu bleomicină ICC: Pulberea de sulfat de bleomicină (Selleckchem, cat. S1214) a fost diluată în H2O pentru a obține o soluție stoc de 10 mg/mL, aliquotată și depozitată la -80C. Cu o zi înainte de tratament, celulele Hap1 WT și Hap1 SNCA KO au fost însămânțate pe coverlips #1,5 acoperite cu PLL în farfurii de 35 mm pentru a fi ~80% confluente în ziua următoare. În ziua tratamentului, mediul normal a fost eliminat și în fiecare farfurie s-au adăugat 2 ml de mediu cald proaspăt care conținea 10ug/mL de bleomicină. În fiecare farfurie s-a adăugat mediu cald proaspăt, fără Bleomicină, pentru celulele Sham. Celulele au fost plasate într-un incubator umidificat timp de 1 oră la 37 C cu 5% CO2. După tratament, mediile au fost îndepărtate și celulele au fost fixate în PFA 4% în PBS timp de 10 minute la RT, spălate de 1 dată în PBS și depozitate la 4 C în PBS până la procedura de colorare.

Tratament cu Bleomicină Western Blot: Cu o zi înainte de tratament, celulele Hap1 WT și Hap1 SNCA KO au fost însămânțate pe plăci de 2 × 10 cm per condiție pentru a fi ~80% confluente în ziua următoare. Tratamentul cu bleomicină s-a făcut la fel ca pentru ICC. După tratament, mediul a fost eliminat și celulele au fost spălate de 1 x cu PBS cald. Celulele au fost recoltate prin tripsinizare și colectate în tuburi conice de 15 ml, peletizate timp de 5 min 200rcf. Lichidul a fost aspirat, peleții au fost resuspendați în 2 ml PBS și transferați în tuburi de microcentrifugare de 2 × 2 ml. Proteinele au fost extrase în fracțiuni citosolice și nucleare cu ajutorul kitului de extracție NE-PER (Thermo-Fisher, cat. 78833) în conformitate cu recomandările producătorului, cu adăugarea unei scurte sonificări (10 secunde, 10 kHz) după prima etapă de resuspensie nucleară. Pregătirile proteice au fost păstrate la -80C până la analiza Western blot.

Pentru imagistica confocală, imaginile au fost achiziționate pe un microscop confocal Zeiss Elyra PS.1 cu un obiectiv Plan-Apochromat 63x/1,40 oil. Toate analizele de colocalizare au fost efectuate cu ajutorul software-ului ImageJ (NIH) prin crearea de ROI pentru fiecare nucleu dintr-o singură imagine situată în mijlocul nucleului în direcția z. Plugin-ul CoLoc 2 a fost utilizat pentru a măsura coeficientul Pearson între semnale și valoarea de fond așteptată după o translație aleatorie a unui canal față de celălalt.

Cerebelul de șoarece

Cerebrele de șoarece de sex masculin (vârsta de 3-6 luni) au fost disecate imediat post-mortem, plasate în 6 ml de PFA proaspăt 4% în PBS și fixate cu un Pelco Biowave Pro timp de 90 de minute la 150 W într-o baie de apă circulantă. Creierele au fost mutate la 4 °C pentru a continua să fie fixate peste noapte. A doua zi, PFA a fost înlocuit cu azidă de sodiu 0,05% și a fost depozitat la 4 °C până la procesarea ulterioară.

După fixare, creierele au fost tranșate în secțiuni flotante coronale sau sagitale de 50 µm cu ajutorul unui Vibratome Leica VT1000S Vibratome. Pentru anumiți anticorpi, a fost necesară recuperarea epitopilor indusă de căldură (HIER) înainte de blocare. Felia de creier a fost adăugată într-un tub conținând tampon HIER (1 mM EDTA, 10 mM Tris Base, 0,05% Tween, pH = 8.5), se fierb la aburi timp de 20 de minute și se răcesc la temperatura camerei timp de 20 de minute. Țesutul a fost blocat timp de 1 oră în tampon de blocare (0,1% Triton-X, 10% ser de capră, în PBS). Anticorpul primar a fost diluat în tamponul de incubare (diluție 1:5 din tamponul de blocare) la o concentrație optimizată pentru fiecare anticorp și incubat peste noapte, la întuneric, în timp ce se agită la temperatura camerei. Țesutul a fost spălat timp de 30 de minute cu PBS de 5 ori. Anticorpul secundar complementar a fost diluat în tamponul de incubare și incubat în mod similar peste noapte la temperatura camerei. În ziua următoare, țesutul a fost spălat cu 5 schimburi de PBS. Colorarea cu DAPI s-a făcut chiar înainte de ultima spălare. Țesutul a fost montat pe o lamă în CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution. O lamelă de acoperire nr. 1,5 a fost sigilată peste țesut cu Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Anticorpii primari utilizați au fost: anticorpul anti-α-Sinucleină fosfo (Ser129) clona 81 A, monoclonal de șoarece, diluție 1:667, Biolegend cat#825701; anticorpul anti-alfa-sinucleină (fosfo S129) , monoclonal de iepure, diluție 1:500, Abcam cat#ab51253; anticorpul anti-asyn (Syn1/mSyn), monoclonal de șoarece, 1:500 diluție, BD Biosciences cat#610786; Anti-pan-ADP-riboză reactiv de legare, iepure, 1:1000 diluție, Millipore cat#MABE1016; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer, clona 10 H (PADPR), pui, 1:100 diluție, Tulip BioLabs cat#1023; Anti-fosfo-Histone H2A.X (Ser139) Clona de anticorpi JBW301, șoarece, diluție 1:500, Millipore cat#05-636; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Clona de anticorpi 20E3, iepure monoclonal, diluție 1:500, Cell Signaling cat#9718 Anticorpii secundari utilizați au fost: Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Clona 20E3, iepure monoclonal, diluție 1:500, Cell Signaling cat#9718: Alexa 647, capră anti-rabit, diluție 1:1000, Invitrogen cat#MPA21245; Alexa 647, capră anti-șoarece, diluție 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, capră anti-rabit, diluție 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, capră anti-rabit, diluție 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, capră anti-rabit, diluție 1:1000:1000 diluție, Abcam cat#ab150078; Alexa 555, capră anti-șoarece, 1:1000 diluție, Abcam cat#ab150114; Alexa 488, capră anti-pui, 1:1000 diluție, Abcam cat# ab150169.

Pentru imagistica confocală, imaginile au fost achiziționate pe o cameră Zeiss Elyra PS.1 microscop confocal cu un obiectiv Plan-Apochromat 63x/1,40 oil. S-au folosit puteri laser de 1-5% pentru a achiziționa z-stacks prin 2-4 regiuni de cortex pe secțiune de țesut. Software-ul de imagistică Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) a fost utilizat pentru a analiza datele IHC. Pentru a segmenta nucleul din citoplasmă, a fost creată o suprafață cu ajutorul canalului DAPI. Au fost analizate doar nucleele neuronale întregi. Informațiile statistice (intensitatea medie, intensitatea sumară, numărul total de suprafețe) pentru fiecare canal au fost exportate și analizate ulterior în Prism 6 (GraphPad). Pentru analiza focarelor din interiorul nucleilor, semnalul nuclear al canalului ales a fost mascat cu ajutorul unei suprafețe nucleare create din canalul DAPI. Din semnalul nuclear al canalului mascat dorit, au fost realizate suprafețe pentru a cuantifica focarele nucleare.

Cerebrul uman

Secțiuni din amigdala din cazuri umane de autopsie de demență cu corpuri Lewy au fost prelevate imediat după autopsie (interval post-mortem de 12-48 de ore), plasate în 6 ml de PFA proaspăt 4% în PBS și fixate cu un Pelco Biowave Pro timp de 90 de minute la 150 W într-o baie de apă circulantă. Secțiunile au fost mutate la 4 °C pentru a continua fixarea peste noapte. A doua zi, PFA a fost înlocuit cu azidă de sodiu 0,05% și depozitat la 4 °C până la procesarea ulterioară.

După fixare, secțiunile de amigdală au fost feliate în secțiuni flotante de 50 µm cu ajutorul unui Vibratome Leica VT1000S. Țesutul a fost blocat timp de 1 oră în Blocking buffer (0,1% Triton-X, 10% ser de capră, în PBS). Anticorpul primar a fost diluat în tamponul de incubare (diluție 1:5 din tamponul de blocare) la o concentrație optimizată pentru fiecare anticorp (a se vedea mai jos) și a fost incubat peste noapte, la întuneric, în timp ce se agită la temperatura camerei. Țesutul a fost spălat timp de 60 de minute cu PBS de 5 ori. Anticorpul secundar complementar a fost diluat în tamponul de incubare și incubat în mod similar peste noapte la temperatura camerei. În ziua următoare, țesutul a fost spălat cu 5 schimburi de PBS. Colorarea cu DAPI s-a făcut chiar înainte de ultima spălare. Țesutul a fost montat pe o lamă în CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution. O lamelă de acoperire nr. 1,5 a fost sigilată peste țesut cu Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Anticorpii principali utilizați au fost: anticorpul anti-α-Sinucleină Phospho (Ser129) clona 81 A, monoclonal de șoarece, diluție 1:667, Biolegend cat#825701; anticorpul anti-fosfo-Histona H2A.X (Ser139) clona 20E3, monoclonal de iepure, diluție 1:500, Cell Signaling cat#9718. Anticorpii secundari utilizați au fost: Alexa 647, capră anti-șoarece, diluție 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 488, capră anti-rabie, diluție 1:1000, Abcam cat#ab150077.

Imaginile au fost capturate pe un microscop Zeiss LSM 880 cu Airyscan. Pentru a determina semnalele specifice ale anticorpilor de la colorarea de fond autofluorescentă crescută în cadrul probelor de țesut uman, s-a utilizat un protocol de neamestec liniar. Modul Lambda a fost utilizat pentru a seta parametrii pentru obiectiv, lasere și dicroice, după cum a fost necesar pentru a obține imaginea probei multicolore. Utilizând aceiași parametri, au fost create spectre de referință individuale din eșantioane colorate cu o singură culoare. În plus, s-a folosit o probă necolorată pentru a determina spectrele de referință de fond. Toate reziduurile au fost minimizate la crearea spectrelor de referință. Proba multicoloră a fost apoi imaginată, specificându-se spectrele relevante de fond și de culoare unică, și a fost dezamestecată cu ajutorul software-ului Zeiss Zen.

S-a folosit software-ul de imagistică Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) pentru a analiza datele IHC. Pentru a segmenta nucleul din citoplasmă, a fost creată o suprafață cu ajutorul canalului DAPI. Au fost analizate doar nucleele neuronale întregi. Informațiile statistice (intensitatea medie, intensitatea sumară, numărul total de suprafețe) pentru fiecare canal au fost exportate și analizate ulterior în Prism 6 (GraphPad). Pentru analiza focarelor din interiorul nucleilor, semnalul nuclear al canalului ales a fost mascat cu ajutorul unei suprafețe nucleare create din canalul DAPI. Pornind de la semnalul nuclear al canalului mascat dorit, s-au realizat suprafețe pentru a cuantifica focarele nucleare.

Atestarea comet a celulelor HAP1

Atestarea comet neutră a celulelor HAP1 a fost realizată în conformitate cu recomandările Trevigen (kitul de testare comet Trevigen, cat#4250-050-K). Suspensiile celulare (2 × 104 celule/ml) în IMDM fără ser (Sigma) amestecate într-un raport de 1:2 cu Comet LMAgarose (Trevigen) au fost pipetate pe CometSlidesTM (Trevigen) și plasate la 4 °C timp de 10-15 minute pentru a se mula. Lamele au fost incubate peste noapte în soluție de liză (Trevigen) la 4 °C la întuneric și apoi în tampon de electroforeză neutru (300 mM acetat de sodiu, 100 mM Tris-HCl, pH 9) timp de 1 oră la 4 °C la întuneric. Lamele au fost electroforezate în tampon proaspăt timp de 40 de minute la 20 V (1 V/cm) la 4 °C. După electroforeză, lamelele au fost incubate mai întâi în tamponul de precipitare a ADN-ului (acetat de amoniu 1 M, 86,6 % EtOH) și apoi în 70% EtOH la temperatura camerei, la întuneric, timp de 30 de minute fiecare și au fost uscate la 37 °C. Lamele au fost colorate cu 1X SYBRTMgreen (Invirogen) în 1X PBS (Gibco) la temperatura camerei timp de 30 de minute la întuneric, au fost scufundate în dH2O de 10 ori pentru a spăla excesul de colorant și au fost uscate la 37 °C. Cometele au fost vizualizate pe un Apotome Zeiss folosind o lentilă de 10X și au fost marcate folosind CometScoreTM.

Bleomycin treatment Comet Assay: Cu o zi înainte de tratament, celulele Hap1 WT și Hap1 SNCA KO au fost însămânțate pe plăci de 2 × 35 mm per condiție pentru a fi ~80% confluente în ziua următoare. Protocoalele de tratament cu bleomicină și Sham au fost efectuate la fel ca pentru ICC. După tratament, mediul a fost eliminat și celulele au fost spălate 1x cu PBS cald. În cazul în care a urmat o perioadă de recuperare, atunci s-a adăugat mediu cald proaspăt și celulele au fost plasate din nou în incubator. Celulele au fost recoltate prin tripsinizare cu 0,05% Tripsin-EDTA (Gibco cat. 15400-54). Celulele tripsinizate din plăci de 2 × 35 mm au fost colectate în tuburi conice de 15 ml și au fost peletizate timp de 5 minute la 200rcf. Lichidul a fost aspirat, peleții au fost resuspendați în 250uL de mediu proaspăt fără FBS sau Penn-Strep, transferați într-un tub de microcentrifugare de 2 ml și depozitați la gheață până la utilizarea în testul Comet, așa cum este descris mai sus.

Testul cometa pe țesut cerebral de șoarece

Tesutul cerebral proaspăt extras de la șoareci masculi (cu vârste de 1, 3, 6-9 luni) a fost tocat fin cu o lamă de ras și suspendat în PBS rece ca gheața (fără Ca2+ și Mg2+) și omogenizat timp de 30 de secunde cu ajutorul unui omogenizator portabil. Țesutul a fost microcentrifugat timp de un minut, iar supernatantul a fost diluat 1:10 în PBS. Celulele au fost numărate cu ajutorul unui hemocitometru și diluate la 1 × 105/ml. Celulele diluate au fost combinate cu agaroză cu punct de topire scăzut (LM) în proporție de 1:2 (v/v) și au fost împrăștiate pe puțul lamei de sticlă comet (kit de testare Trevigen comet, cat#4250-050-K). Lamele au fost uscate la întuneric la 4 °C timp de 15 minute și au fost plasate în soluția de liză a kitului la 4 °C peste noapte. Excesul de tampon a fost drenat de pe lamele înainte de imersia în 50 ml de TBE, pH 7,4, timp de 30 de minute la 4 °C. Lamele au fost supuse unei electroforeze în TBE, pH 7,4, la 20 V timp de 40 de minute la 4 °C. Excesul de TBE a fost drenat și lamelele au fost plasate în dH2O de două ori timp de 5 minute. Apoi, lamelele au fost plasate în 70% EtOH timp de 5 minute și au fost uscate la 37 °C timp de 15 minute. 100 µl de 1X SYBR-Green au fost pipetați pe fiecare cerc de agaroză uscată, iar probele au fost colorate timp de 30 de minute la temperatura camerei, la întuneric. Excesul de soluție SYBR-Green a fost îndepărtat și lamelele au fost clătite în dH2O de mai multe ori. Lamele au fost lăsate să se usuce complet la 37 °C și au fost depozitate la 4 °C. Cometele au fost vizualizate la un microscop Zeiss ApoTome cu un obiectiv de 10X și au fost marcate cu ajutorul software-ului CometScore™ (TriTek).

Electrophoretic mobility shift assay

Prepararea ADN-ului

Fragmente de 300 bp au fost extrase dintr-un ladder de 100 bp (NEB) separate pe un gel de agaroză 1% la 175 V timp de 2 ore la RT cu ajutorul kitului QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). ADN-ul a fost curățat cu ajutorul kitului DNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research) și eluat în 1X TE. Concentrația finală și puritatea ADN-ului au fost determinate cu Nanodrop.

Electrophoretic mobility shift assay

Fragmentele de ADN (20 ng) au fost amestecate cu hu_ser129_phospho-syn recombinant (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg și 16 µg; Proteos, Inc.), hu_α-sinucleină recombinantă (250 ng, 1 µg, 1 µg, 4 µg, 8 µg și 16 µg; Proteos, Inc.) sau glutation S-transferază recombinantă (250 ng, 1 µg, 1 µg, 4 µg, 8 µg și 16 µg; GenScript) într-o reacție de 20 μL care conține 94 mM Tris-Cl, pH 8,0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA și 5% ficoll la gheață timp de 20 min, apoi la temperatura camerei timp de 30 min. După adăugarea a 2 μL de 10X Orange Loading Buffer 10X (Licor), 8 μL de reacție totală au fost încărcate într-un gel TBE de poliacrilamidă 10% sau 6% (Novex) și rulate la 100 V timp de 2 ore la RT. Gelurile au fost colorate timp de 30 de minute cu 10X SYBRTM Safe DNA Stain (Invitrogen) în 1X TBE. Imaginile au fost achiziționate cu ajutorul sistemului de imagistică Fluorchem M și cuantificate cu ajutorul instrumentului ImageJ Gel Analyzing.

Western blot

Gelurile TBE de poliacrilamidă 10 % au fost transferate pe o membrană de nailon Biodyne™ B (Thermofisher Scientific) la 30 V timp de 1 oră și 16 minute la gheață în TBE 0,5X cu ajutorul Novex XCell II Blotting System (Invitrogen). Membranele au fost blocate peste noapte în Odyssey PBS Blocking Buffer (Li-Cor) și colorate timp de 1 oră la RT cu Syn1 (1:1.000; Biolegend) și peste noapte la 4 °C cu IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG (1:10.000; Li-Cor). Imaginile au fost achiziționate cu ajutorul Li-Cor Odyssey CLx Imaging System.

Western Blot pentru Hap1 Pregătiri proteice nucleare: Concentrațiile preparatelor proteice citoplasmatice și nucleare Hap1 NE-PER au fost cuantificate utilizând kitul Pierce BCA Protein Assay (Pierce, cat. 23225) și citite pe un fotometru pentru microplăci Multiskan FC (Fisher, cat. 51119000) cu o citire de 550 nm. 5 µg & 10 µg de proteină nucleară au fost diluate în tampon de probă SDS (Novex, cat. LC2676) + BME (Gibco, cat. 21985-023) și încărcate pe un gel Tris-Glicină 10-20% (Novex, cat. XP10202BOX). S-au încărcat 3 µL de scara de proteine colorată (NEB, cat. P7719) pentru referință. Gelul a fost analizat cu ajutorul Novex Xcell Blotting System în tampon SDS (Novex, cat. LC2675) timp de 70 de minute la 120 V. Gelul a fost dezasamblat și pregătit pentru transferul pe o membrană Immobilon-FL PVDF (Millipore, cat. IPF00010). Gelul a fost transferat în tampon de transfer Tris-Glicină (Novex, cat. LC3675) la gheață timp de 2 ore la 25 V. După transfer, membrana a fost îndepărtată și fixată imediat în 4% PFA + 0,01% Glutaraldehidă timp de 10 minute cu agitare ușoară la RT. Membrana a fost spălată 1 dată în milliQ H2O și colorată cu kitul de colorare a proteinelor totale REVERT (LI-COR, cat. 926-11010) în conformitate cu protocolul producătorului. Proteina totală colorată a fost achiziționată cu ajutorul LI-COR Odyssey CLx Imager. După inversarea colorației REVERT, membrana a fost spălată de 1 dată în milliQ H2O și blocată în Odyssey Blocking Buffer (LI-COR, cat. 927-40000) peste noapte la 4 C cu agitare ușoară. Anticorpii primari au fost diluați la 1:1000 în Blocking Buffer și au fost incubați timp de 2 ore la temperatura camerei cu agitare ușoară. Membrana a fost spălată de 3 ori în 0,1% Tween20 în PBS timp de 10 minute. Anticorpii secundari (LI-COR IR680LT donkey anti-rabbit cat. 926-68023; IR800CW măgar anti-șoarece cat. 926-32212) au fost diluați la 1:10000 în tampon de blocare și au fost incubați timp de 1 oră la temperatura de repaus cu agitare ușoară. Membrana a fost spălată de 3 ori cu 0,1% Tween20 în PBS timp de 10 minute și de 1 dată în PBS timp de 10 minute, la RT. Imaginile au fost achiziționate cu ajutorul LI-COR Odyssey CLx Imager. Analiza a fost efectuată pe FIJI cu ajutorul analizatorului de gel. Semnalul anticorpilor a fost normalizat în raport cu proteina totală REVERT.

Sondaj de îmbinare finală a ADN-ului mediat de ligază T4

Care reacție de îmbinare finală conține 150 ng dintr-un produs PCR de ADN de 1,2 kb digerat la capetele 5′ și 3′ cu enzima de restricție XhoI (NEB RO146S). Reacțiile se efectuează într-un volum de reacție de 20 µL care conține 150 ng de ADN digerat, 2,8 µL de tampon proteic (10 mM Tris, 50 mM NaCl pH = 7,6), 5,3 µL de glicerol 20% în PBS + Mg + Ca, 2 µL de tampon de ligază T4, 200 ng sau 40,5 ng de proteină, 25U de ligază T4 (NEB M0202) și H2O steril până la volum. Toate componentele, cu excepția ligazei T4, au fost combinate și incubate la gheață timp de 15 minute. 25U de ligază T4 au fost adăugate la reacție și incubate la RT timp de 90 de minute. După incubare, reacția a fost imediat curățată cu o coloană Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research) și eluată în 15 µL de H2O sterilă. La ADN s-a adăugat SybrGreen și tamponul de încărcare, iar probele au fost electroforezate într-un gel TAE de agaroză 1% timp de 1 oră la 135 V și au fost imaginate pe un aparat de imagistică cu chemiluminescență și fluorescență Syngene G:BOX. ImageJ a fost utilizat pentru a analiza imaginea gelului, iar datele au fost reprezentate grafic folosind Prism 6 (GraphPad).

Proiectare experimentală & analiză statistică

Toate valorile cuantificate sunt raportate ca medie ± SEM. Tipul și numărul de probe relevante (N), precum și testele statistice utilizate pentru a evalua semnificația pentru fiecare experiment sunt prezentate împreună cu fiecare set de date. Mărimile eșantioanelor utilizate în fiecare experiment s-au bazat pe estimări ale mărimilor de efect preconizate (~10-50%) și pe abaterile standard din datele preliminare și au avut puterea de a detecta diferențele cu un nivel de semnificație de 0,05 (α) și o putere de 0,9 (1-β).

.