Eșantioanele apoase, celulele lizate sau țesuturile omogenizate se amestecă cu volume egale de un amestec fenol:cloroform. Acest amestec este apoi centrifugat. Deoarece amestecul fenol:cloroform este imiscibil cu apa, centrifuga va determina formarea a două faze distincte: o fază apoasă superioară și o fază organică inferioară. Faza apoasă se ridică în partea superioară deoarece este mai puțin densă decât faza organică care conține fenol:cloroform. Această diferență de densitate este motivul pentru care fenolul, care are doar o densitate puțin mai mare decât apa, trebuie amestecat cu cloroformul pentru a forma un amestec cu o densitate mult mai mare decât cea a apei.
Lipidele hidrofobe se vor partiționa în faza organică inferioară, iar proteinele vor rămâne în interfața dintre cele două faze, în timp ce acizii nucleici (precum și alți contaminanți, cum ar fi sărurile, zaharurile etc.) rămân în faza apoasă superioară. Faza apoasă superioară poate fi apoi eliminată cu pipeta. Trebuie avut grijă să se evite pipetarea oricărei faze organice sau a materialului de la interfață. Această procedură se efectuează adesea de mai multe ori pentru a crește puritatea ADN-ului. Această procedură produce ADN dublu catenar mare care poate fi utilizat în PCR sau RFLP.
Dacă amestecul este acid, ADN-ul va precipita în faza organică, în timp ce ARN-ul rămâne în faza apoasă. Acest lucru se datorează faptului că ADN-ul este mai ușor de neutralizat decât ARN-ul.
Există unele dezavantaje ale acestei tehnici în utilizarea criminalistică. Este consumatoare de timp și utilizează reactivi periculoși. De asemenea, deoarece este un proces în două etape care implică transferul de reactivi între tuburi, prezintă un risc mai mare de contaminare.
.