- Abstract
- 1. Introduktion
- 2. Material och metoder
- 2.1. Växtmaterial
- 2.2. DNA-extraktion
- 2.3. Mikrosatellitanalys
- 2.4. Statistisk analys
- 3. Resultat och diskussion
- 3.1. Utveckling av SSR-baserade testsystem för identifiering av genotyper i Aspen
- 3.2. Analys av klonstruktur i inhemska aspbestånd
- 3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
- 4. Slutsats
- Interessentkonflikter
- Acknowledgments
- Supplementary Materials
Abstract
Testningssystem för molekylär identifiering av mikroförökade elitgenotyper av asp (Populus tremula L.) utvecklades med utgångspunkt i mikrosatellitloci (SSR). Av 33 testade mikrosatellitloci valdes 14 ut på grund av hållbar PCR-amplifiering och betydande variabilitet i elitkloner av asp som syftar till att etablera snabbt roterande skogsplanteringar. Alla åtta testade kloner hade olika multilocusgenotyper. Bland 114 träd från tre inhemska referensbestånd i närheten av de etablerade planteringarna identifierades 80 haplotyper, medan vissa upprepade genotyper tillskrevs naturliga kloner som uppstod som ett resultat av utväxten. Den utvalda uppsättningen SSR-markörer visade tillförlitlig individidentifiering med låg sannolikhet för förekomst av identiska aspgenotyper (minst 1 × 10-4 för obesläktade och besläktade individer respektive 1 × 10-4 för besläktade individer). Fallstudier som visar praktiska tillämpningar av testsystemet beskrivs, inklusive analys av klonstruktur och nivåer av genetisk mångfald i tre naturliga aspbestånd som växer i de regioner där planteringar av elitkloner etablerades.
1. Introduktion
Den fortsatta försämringen av inhemska skogar i hela världen på grund av överexploatering kräver införande av intensiva former av skogsbruk som skulle gynna inte bara ekonomisk effekt utan också bevarande av genetiska resurser för vedartade växter. Denna uppgift förklarar erhållande och underhåll av elitgenotyper av skogsträd som är avsedda för snabbt roterande skogsplanteringar. Nya högproduktiva och hållbara sorter som är motståndskraftiga mot abiotiska faktorer, skadedjur och patogener uppstår som ett resultat av förädling, urval av mutationer och/eller genteknik. Genom klonförökning av sådana framstående individer säkerställs att deras användbara egenskaper fixeras både för ytterligare förädlingsexperiment och för etablering av målinriktade skogsplanteringar. Mikroklonal förökning via in vitro-odling möjliggör snabb, storskalig och kostnadseffektiv kloning av individer med önskade egenskaper, särskilt när traditionell knoppning eller ympning är omöjlig eller kräver särskilda insatser.
Då morfologiskt och anatomiskt olika växtkloner kan se likadana ut är det viktigt att på ett tillförlitligt sätt kunna identifiera dessa kloner och särskilja dem från varandra och från artfrämmande individer eller representanter för andra närbesläktade arter. Inom skogsbruket är problemet med identifiering av individer särskilt viktigt eftersom trädens yttre utseende i hög grad beror på miljöparametrar . I vissa stadier av skogsträdens naturliga ontogenes, t.ex. plantor och plantor, och särskilt som kallus eller explantationer i cellkulturer in vitro, kan individer vara omöjliga att urskilja, inte bara individuellt utan också när det gäller artdiagnoser. Lång generationstid och ontogenetiskt sen mognad gör uppgiften att genetiskt passportera elitkloner av vedartade växter verklig. Den komplexa flerstegsprocessen för att erhålla, föröka och introducera elitsorter genom förädling eller genteknik ökar sannolikheten för olika fel.
Molekylära genetiska markörer (MGM) visade sig vara mycket effektiva verktyg för individidentifiering. Bland de olika MGM-klasserna passar mikrosatelliter eller enkla sekvensrepetitioner (SSR) bäst in i testsystemens krav på identifiering på grund av deras specificitet, kodominans, selektiva neutralitet, tillräckliga allelrikedom och heterozygositet på grund av den höga mutationsfrekvensen. Dessutom kan SSR-markörer och PCR-primers för amplifiering av dem överföras från ett taxon till ett annat på grund av den relativa bevarandet av arvsmassan inom släkten och växtfamiljer.
I flera poppelarter har framgångsrik DNA-fingerprinting och differentiering av kloner, odlingar och sorter påvisats med hjälp av molekylära markörer, inklusive SSR-lokationer.
I den här artikeln rapporterar vi om utvecklingen av ett SSR-baserat testsystem för molekylärgenetisk identifiering av elitgenotyper av asp (Populus tremula L.) som förökats genom mikroförökning, som syftar till att etablera snabbväxande målskogsplanteringar i flera regioner i Ryska federationen, och vi presenterar resultaten av dess tillämpning för diskriminering av enskilda genotyper, studier av klonstruktur i naturliga aspbestånd och uppskattning av den genetiska variabiliteten i populationer.
2. Material och metoder
Utvecklingen av testsystemet för identifiering av elitgenotyper omfattade urvalet av en specifik marköruppsättning som passar kraven på högupplöst diskriminering av kloner och testning av dess tillförlitlighet och identifieringskraft på en uppsättning elitgenotyper och ett tillräckligt antal representanter för en studerad art.
2.1. Växtmaterial
Elitasp- och hybridkloner som använts för utveckling av testsystem för molekylär identifiering har erhållits från mikroförökade cellkulturer som underhålls i Pushchino-filialen av Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (Pushchino, Ryssland). Origin and short description of eight clones are presented in Table 1.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Experimental aspen clonal plantations derived from these elite genotypes were established in four regions of European part of Russia (Figure 1). Native aspen stands located closely to these plots were used for studies of clonal structure, evaluation of frequencies of multilocus genotypes, and calculations of probabilities of appearance of identical allelic combinations in a single genotype.
Prisady. Försöksplatsen ligger 1 km väster om bosättningen Prisady i Serpukhovsky Raion (distrikt) i Moscow oblast’ (Ryssland). Blad från 52 unga eller medelålders (ca 10-25 år) aspar från ett naturligt mångåldersbestånd som ligger i närheten (1 km) av denna tomt har använts som referenspopulation.
Voronezh. Sjutton träd provtogs i ett bestånd i anslutning till försöksområdet i Voronezh Oblast. Ytterligare 13 träd samlades in längs floden Voronezj-flodens strand i staden Voronezj nära planteringen.
Yoshkar-Ola. Unga inhemska bestånd av asp var källan till de träd som användes som referenspopulation för en försöksyta nära staden Yoshkar-Ola i republiken Mari-El. Blad från 32 träd samlades in.
För att minimera den tillfälliga provtagningen av individer med vegetativt ursprung (genom spirande) samlade vi in blad från träd på ett avstånd av minst 15-20 m från varandra. Detta tillvägagångssätt användes för att inkludera referensprover av främst öppet pollinerade plantor med maximal genetisk mångfald. På grundval av enbart trädens yttre utseende och avståndet mellan träden kunde man dock inte undvika att ta prover av de grenar som uppkommit till följd av spiring, vilket senare genetisk analys bekräftade.
Skottar med löv klipptes av med hjälp av en mekanisk skärare med en teleskopisk mast av aluminium. Insamlade skott med blad placerades i plastpåsar i högst sex dagar vid 4°С tills de bearbetades. Provberedningen omfattade DNA-extraktion och placering av reservbladvävnadsfragment i märkta zip-påsar med kiselgel för långtidsförvaring. Utanför den aktiva vegetationsperioden kan vilande vegetativa knoppar framgångsrikt användas för DNA-extraktion.
2.2. DNA-extraktion
Fragment av blad på cirka 350-500 mg som togs från explanter som växte in vitro på ett specialmedium (REF) i petriskålar användes för DNA-extraktion.
För träd från inhemska populationer extraherade vi DNA från 350-500 mg fragment av färska eller 200-300 mg kiseldioxidtorkade bladvävnader med hjälp av en modifierad metod med cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB) .
2.3. Mikrosatellitanalys
Mikrosatelliter, eller SSR, utgör en klass av tandemiskt upprepade DNA-sekvenser med korta (1-6 par nukleotider, bp) motiv som skiljer sig åt i antal kopior mellan individer på grund av hög mutationsfrekvens. Flera alleler som vanligen finns i kodominanta mikrosatellitloci skapar ett stort antal unika genotypiska kombinationer, vilket garanterar en tillförlitlig identifiering av dem, särskilt när ett tillräckligt antal loci används. Tekniskt sett kräver analysen av SSR-polymorfism endast polymeraskedjereaktion (PCR) och efterföljande elektrofores (gel eller kapillär) för fragmentanalys. Vid utvecklingen av testsystemet valde vi den variant av metoden som endast använder grundläggande utrustning och enkla reagenser. Detta säkerställde ökad reproducerbarhet av förfarandena i alla PCR-laboratorier och gjorde det möjligt att uppnå hög kostnadseffektivitet i analysen, vilket är avgörande för storskalig praktisk klonidentifiering.
Med tanke på att ett stort antal nukleära SSR-lokaler för poppel hittades i litteraturen och i primerdatabaser beslutade vi att välja ut från flera publikationer och testa primers som kan användas för rutinmässig genotypidentifiering baserad på mycket enkel utrustning utan användning av DNA-analysatorer. En första uppsättning SSR-primers för deras potentiella användning som delar av testsystemet för molekylär identifiering av asp var ett resultat av sökning i bibliografiska databaser (Thomson Reuters Web of Science, http://webofknowledge.com/) och i Molecular Ecology Resources Primer Database (http://tomato.bio.trinity.edu/.
DNA-amplifiering utfördes med hjälp av PCRCore-satser (Isogen Laboratories, Ltd., Moskva, Ryssland) i BioRad Inc. (USA) Dyad Thermo cycler. Mikrosatellitloci (se tabell 2) från serierna ORPM och WPMS amplifierades med specifika primers i en koncentration av 1 mmol/mL och 5-10 ng mål-DNA med följande temperaturprofil: (1) inledande denaturering vid 94°С i 3 minuter, (2) 30 cykler bestående av 30 sekunders denaturering vid 94°С, glödgning av primers vid varierande temperatur och tid (se tabell 3 för den slutliga glödgningstemperaturen som rekommenderas efter justering av förfarandet) och förlängning vid 72°С i 1,5 minuter följt av (3) slutlig förlängning vid 72°С i 10 minuter och (4) nedkylning av PCR-blandningen till 4°С.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Comments: 1Tuskan et al., 2004 ; 2Smulders et al., 2001 ; 3by literature data in different Populus species (P. tremula, P. x canescens, and P. alba). | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1P: polymorphic, M: monomorphic, and N: no PCR amplification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PCR-produkterna genomgick elektrofores i 6-procentiga polyakrylamidgelblock med hjälp av Tris-EDTA-borat-buffersystem. Efter att elektroforesegelen färgats i ethidiumbromidlösning och visualiserats i UV-ljus fångades och sparades grafiska bilder med hjälp av Doc-Print II Vilber Lourmat geldokumentationssystem och bearbetades i grafiska editorer. Fragmentens storlek uppskattades med hjälp av specialiserad programvara (Photo-Capt). DNA från E. coli plasmid pBR322, begränsat av endonukleas HpaII användes som molekylviktmarkör.
2.4. Statistisk analys
Klonidentitet bestämdes med hjälp av multilocus matchanalys för kodominanta data. Genotypsannolikheten (GP), som innebär sannolikheten för förekomsten av en viss multilocuskombination i populationen, och identitetsannolikheten, som uppskattar sannolikheten för slumpmässig matchning av två obesläktade (PI) eller besläktade (PIsib) individer med hjälp av en viss uppsättning loci, beräknades på grundval av fördelningen av allelfrekvenser i populationsproverna.
Svarigheten mellan de observerade genotypfördelningarna för varje SSR-lokus och den förväntade enligt Hardy-Weinberg-jämvikt testades med hjälp av chi-två-kriteriet. Allelantalet och observerade och förväntade heterozygotier beräknades för varje inhemskt prov. Vi använde Wrights F-statistik för att bedöma den genetiska indelningen bland de studerade populationsproven. Alla ovan nämnda beräkningar utfördes i tilläggsprogrammet för MS Excel, GenAlEx 6.5 .
3. Resultat och diskussion
3.1. Utveckling av SSR-baserade testsystem för identifiering av genotyper i Aspen
För inledande testning valde vi 33 heterologiska tri-, tetra-, penta- och hexanukleotidmikrosatellitloci från två uppsättningar; serien ORPM utformades först för Populus trichocarpa och serien WPMS utformades för Populus nigra . Dessa loci har egenskaper som anges i tabell 2. De första testerna gjordes på DNA-prover från tre kloner (47-1, PtV22 и С-kontroll) från en in vitro-samling som förvarades och förökades i Pushchino-filialen vid Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (Pushchino, Moscow Oblast, Ryssland). I detta skede testades även deras variabilitet på 20-24 exemplar av vild asp från Novosibirsk Oblast (västra Sibirien, Ryssland) och Krasnoyarsk Krai (mellersta Sibirien, Ryssland).
Som ett resultat av den första testfasen amplifierades 24 loci framgångsrikt och nio andra loci gav inte upphov till PCR-produkter. Av de 24 loci som producerade PCR-fragment visade sig 20 loci vara variabla med ett antal alleler från två till nio, medan fyra loci som framgångsrikt amplifierades var monomorfa (tabell 3). Efter ytterligare tester med varierande PCR-regimer valde vi slutligen ut 14 loci med tillförlitlig amplifiering och betydande polymorfismnivå för att inkluderas i testsystemet för molekylärgenetisk identifiering. Exempel på variabiliteten hos de utvalda mikrosatellitloci i asp visas i figurerna 2 a och 2 b.
(a)
(b)
(a)
(b)
De erhållna multilocusgenotyperna av åtta elitkloner och referensgenotyper av vilda träd från inhemska bestånd förtecknas i tabell S1 i det kompletterande materialet som finns tillgängligt online på http://dx.doi.org/10.1155/2015/261518. Vi analyserade upp till 8 rameter som provtagits i olika faser av den mikroklonala förökningen. Inom klonerna var genotyperna stabila och entydigt reproducerade bland rameterna oberoende av förökningsstadiet. Efter uteslutning av rameter av samma genet var både elitkloner och aspgenotyper från inhemska populationer som ingick i referensproverna 100 % olika. Sannolikheten för förekomsten av genotyper (GP: genotypsannolikhet) bland elitkloner varierade från 2,4 – 10-21 till 1,7 – 10-11, bland träd i referensproverna från 4,0 – 10-24 till 5,8 – 10-9. Sannolikheten för att två orelaterade genotyper ibland sammanfaller (PI: sannolikhet för identitet) varierade från 4,8 – 10-10 i Yoshkar-Ola till 4,3 – 10-13 i Prisady. Justerat till den teoretiska sannolikheten för att de jämförda individerna härstammar från samma förfäder låg den mer konservativa uppskattningen (PIsibs) inom intervallet 1,0 – 10-4 i Yoshkar-Ola till 9,3 – 10-6 i Voronezh. Alla värden är ganska låga, vilket innebär att den teoretiska frekvensen av upprepbara genotyper på grund av rekombination av olika könsceller i samband med fröförökning inte överstiger cirka 1 av 10 000 jämförelser med en identisk allelkombination som hittats av misstag. Förhållandet mellan PI och PIsibs och antalet använda loci visas i figur 3 och visar att sannolikheten för uppkomsten av identiska genotyper är praktiskt taget försumbar när man använder de första 7-8 loci som valts ut för att ingå i testsystemet. Att använda alla 14 loci garanterar ytterligare tillförlitlighet och robusthet i förfarandet.
Utvecklingen av mikrosatellitloci för arter av släktet Populus inleddes i slutet av 1900-talet tillsammans med tekniker för molekylärgenetiska markörer. År 1998 utformades en av de första uppsättningarna primers för amplifiering av dinukleotiska SSR-lokus för amerikansk darrpoppel, Populus tremuloides . I denna artikel visas en framgångsrik korsamplifiering av samma markörer för flera andra poppelarter, P. deltoides, P. nigra, P. x canadensis och P. maximowiczii. Författarna har också föreslagit ett brett spektrum av användningsområden för SSR-luci för olika ändamål, bland annat klonidentifiering, analys av kontrollerade parningar, kartläggning av arvsmassan, markörstödd selektion, analyser av genetisk mångfald och stöd till program för bevarande och hållbar förvaltning av skogens genetiska resurser. Senare studier gav åtta andra dinukleotid-SSR-lokaler för Populus tremuloides . Sedan dess har mikrosatellitlinser utvecklats för andra arter, däribland P. nigra . Några av dessa loci amplifierades också i P. deltoides, P. trichocarpa, P. tremula, P. tremuloides, P. candicans och P. lasiocarpa. Särskilda primer för SSR-loci utformades för Populus euphratica . Senare användes denna uppsättning för utveckling av multiplexpaneler som användes för uppskattning av den genetiska mångfalden hos denna art.
Nästa generationens sekvensering var det effektivaste sättet att upptäcka tandemrepetitioner i poppelgenomet och att utforma SSR-primers som kan överföras på deras baser, vilket visades i fallet med balsamisk poppel, Populus trichocarpa . Sådana universella korsamplifierade loci används för art- och hybrididentifiering och för uppskattning av genetisk differentiering bland släktingar.
Mikrosatelliter är också användbara för att kontrollera den somaklonala mångfalden inom en pool av vävnader som erhållits genom mikroklonal förökning från ett enda donatorträd, för identifiering av enskilda kloner med avseende på deras tolerans mot miljöfaktorer. Vi har inte observerat någon variation i SSR-mönstren mellan rameter från samma elitklonala linje. Kärnmikrosatelliter tillsammans med andra klasser av molekylära markörer används också för att bestämma ploidinivån hos poppel, och vi fann indikationer på triploidi hos flera genotyper. Triploida asphybrider uppvisar ofta ökad vitalitet och motståndskraft mot patogener, så denna fråga bör studeras vidare med hjälp av karyologiska och flytande cytometrianalyser.
3.2. Analys av klonstruktur i inhemska aspbestånd
Sedan vid provtagningen i fält av material i vilda bestånd försökte vi undvika att inkludera klonala förgreningar som uppstått som groddplantor, vilket är vanligt för aspar. I alla undersökta bestånd tillämpades samma provtagningsschema med minst 15-20 m mellan träden. Trots detta hittades rameter av samma klon, vilket tyder på att vegetativ förökning är vanligt förekommande, i alla studerade naturliga bestånd (tabell S1).
Prisady. Bland de studerade 52 träden hittade vi 41 olika haplotyper; en multilocusgenotyp hittades nio gånger och en hittades tre gånger. Vi drog slutsatsen att dessa upprepade multilocuskombinationer berodde på att provtagningsskotten var rameter av samma klon.
Voronezh. Bland 17 träd som samlades in i nära anslutning till platsen för försöksodlingen hittades inga klonindivider. Tretton träd som samlades in vid floden Voronezj representerades av åtta genotyper: fyra av dem fanns i ett exemplar, tre visade sig vara två vägrenar av samma klon, och en genotyp hittades i tre exemplar som uppenbarligen härstammade från utsprängning av redan existerande stamceller. Totalt identifierade vi 25 olika haplotyper i detta referenspopulationsprov.
Yoshkar-Ola. Trettiotvå analyserade träd kombinerades till 13 olika haplotyper som identifierades genom multilocus matchningsanalys; en genotyp förekom två gånger, en genotyp förekom fem gånger, en genotyp förekom sju gånger och en genotyp förekom nio gånger. Upprepade genotyper motsvarade uppenbarligen grenar som uppkommit genom spirande.
Vi drog slutsatsen att spirande och hög klonalitet är ett utbrett fenomen i inhemska aspbestånd. I asp, liksom i många andra popplar, kan vegetativa kloner uppta stora områden. För att samla in ett prov utan upprepade klongenotyper bör därför avstånden mellan träden ökas till minst 40-50 m. En mer exakt uppskattning av den maximala spridningen av en enskild klon över beståndets territorium kräver dock också särskilda undersökningar.
För andra tillämpningar var nukleära SSR-loker användbara för studier av klonstrukturer och genetiska relationer mellan klongenotyper i inhemska bestånd eller mellan inhemska och konstgjorda bestånd. Variation in level of clonality was observed, for instance, in black poplar, P. nigra . Extensive clonal assemblies were found by means of SSR analysis also in European black poplar , in the taxonomic continuum P. alba – P. x canescens on the Iberian Peninsula , and in other poplar species.
3.3. Levels of Intra- and Interpopulation Genetic Variability
All the loci of the selected set were polymorphic in all studied native population samples. Values of average allele number, effective allele number, and observed and expected heterozygosity were slightly higher in Prisady and Voronezh than in Yoshkar-Ola (Table 4).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| s.e.: standard error. : sample size. : mean number of alleles. : effective number of alleles. : observed heterozygosity. : expected heterozygosity. : unbiased expected heterozygosity. : fixation index (intrapopulation coefficient of inbreeding). |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
The averaged over loci (proportion of inter-population variation in total variation, Table 5) was 0.058 ± 0.014 with the highest values observed in two loci: ORPM202 (0.164) and WPMS14 (0.162). AMOVA test showed that 6% of total molecular variation was among populations (significant, ), 10% were among individuals, and 84% were within individuals.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| s.e.: standard error. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Microsatellites isolated from nuclear as well as chloroplast genomes were employed for the analysis of genetic diversity and genetic structure in various poplar species . De nivåer av genetisk mångfald inom populationen som vi observerade i inhemska aspbestånd låg inom intervallet för de värden som vanligen observeras hos poppel och som uppskattas genom SSR-analys av loci ( och referenser däri).
Ett stort antal studier som använder mikrosatellitteknik fokuserade på upptäckt av hybridisering i naturliga eller konstgjorda bestånd av poppel. SSR-loci bidrar till att avslöja mekanismer för interspecifik korsning och reproduktiv isolering. I denna studie koncentrerade vi oss på variation mellan individer och mellan populationer snarare än på mellanspecifika skillnader, men när det gäller vissa av de studerade elitklonerna bör deras hybridursprung testas genetiskt med hjälp av en komplex uppsättning markörer, men med nukleär och cytoplasmatisk lokalisering. Ett stort antal publikationer har rapporterat om hög tillförlitlighet vid identifiering av interspecifika hybrider och industriella kloner. I en anmärkningsvärd publikation rapporteras om den genetiska identiteten hos vissa industriella kloner av poppel som tidigare behandlats som olika .
Den praktiska uppgiften att övervaka identiteten hos kommersiella kloner i in vitro-samlingar liknade den som användes i den aktuella forskningen. I alla tillämpningar där tillförlitlig individuell identifiering krävdes visade SSR:er hög effektivitet.
4. Slutsats
Användning av nukleära mikrosatellitloci för genetisk identifiering och bedömning av genetisk variabilitet i aspens elitkloner och inhemska bestånd visade hög effektivitet hos det utvecklade billiga SSR-baserade testsystemet. En tillförlitlig autentisering av kloner säkerställer genetisk övervakning av mikroklonförökning och gör det möjligt att avslöja klonalitet i inhemska bestånd. Vi har visat att samma uppsättning mikrosatellitloci framgångsrikt kan användas för att uppskatta nivåerna av genetisk variabilitet inom och mellan populationer hos asp. Rekonstruktion av släktskap mellan enskilda elitkloner eller genetiska relationer mellan naturligt parande populationer är perspektiviska uppgifter som kan förverkligas i framtiden med hjälp av samma markörer.
Interessentkonflikter
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter i samband med publiceringen av denna artikel.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av Ryska federationens ministerium för utbildning och vetenskap (projekt nr 14.607.21.0044 från 22.08.2014; unik identifierare RFMEFI60714X0044). Författarna tackar också E. M. Romanov, A. I. Shurgin, R. V. Sergeev (Volga State University of Technology, Yoshkar-Ola, Republic of Mari El, Ryssland), M. V. Drapaluk, A. V. Tzaralunga, A. A. Reshetnikov, E. O. Kolesnikova (Voronezh State Forestry Engineering University, Voronezh, Ryssland) och G. B. Kolganikhina (Institute of Forest Science RAS, Uspenskoe, Moskvaregionen, Ryssland) för deras hjälp med insamling av prover i inhemska bestånd. Författarna är också tacksamma mot M. Zeps, D. Auzenbaha och A. Gailis (Latvian State Forest Research Institute ”Silava”, Salaspils, Lettland) för att de delat med sig av biologiskt material och information om aspens elitkloner.