Gap Junctions in Cardiovascular Disease

Gap Junctions, specialiserade membranstrukturer som består av ett antal intercellulära kanaler, förbinder intilliggande celler i många vävnader och organ och möjliggör därmed kemisk och elektrisk kommunikation. I hjärtat tillhandahåller gap junctions vägar för intercellulärt strömflöde, vilket möjliggör samordnad spridning av aktionspotential. På senare tid har många rapporter publicerats som tyder på att förändringar i gap junctions distribution, täthet och egenskaper kan vara inblandade i initiering och fortbestånd av olika hjärtarytmier. I denna översikt sammanfattar vi de data som presenteras i dessa rapporter och diskuterar funktionella implikationer.

Struktur och egenskaper hos gap junction-kanaler

Under det senaste decenniet har strukturen och egenskaperna hos gap junction-kanaler dokumenterats i stor utsträckning, vilket diskuteras i flera nyligen publicerade översikter.1234

Gap junction-kanaler hos däggdjur är uppbyggda av connexiner som kodas av en familj av närbesläktade gener. Alla connexiner består av 4 mycket konserverade α-helikala membranöverskridande segment som separeras av 2 extracellulära och 1 intracellulär slinga. Amino- och karboxyterminerna är belägna intracellulärt. Femton medlemmar av däggdjursconnexinfamiljen har identifierats. De skiljer sig främst åt i sekvensen av deras intracellulära slingor och karboxyterminaler. Mellan kardiomyocyter har tre connexiner upptäckts på proteinnivå: connexin40 (Cx40), connexin43 (Cx43) och connexin45 (Cx45) (namngivna efter sin förmodade molekylmassa i kilodalton).

En gap junction-kanal bildas genom att två hemikanaler (connexoner), som var och en består av sex connexinmolekyler som är hexagonalt arrangerade runt en vattenpora, dockas med huvudet mot huvudet. Eftersom dockningen sker med hjälp av relativt bevarade extracellulära slingor kan många connexoner som består av en typ av connexin kombineras med connexoner som består av andra connexiner för att bilda heterotypiska gap junction-kanaler. En connexon kan också bestå av olika connexiner5 (heteromerisk connexon). I hjärtat samlokaliseras olika connexiner i gap junction plack, men det är okänt om det finns heterotypiska och/eller heteromeriska gap junction-kanaler i det kardiovaskulära systemet.

Gap junction-kanaler är permeabla för ämnen med en molekylvikt på <≈1 kDa. Permeabiliteten beror på connexintyp och laddning av den permeerande molekylen. Gap junction channels beter sig som gated jonkanaler. I kardiomyocyter varierar konduktanserna för enskilda kanaler från ≈20 pS för homotypiska Cx45-kanaler till 75 pS för Cx43-kanaler och till ≈200 pS för Cx40-kanaler. Gap junction-konduktansen moduleras av transjunktionell spänning, av i6 och i, av connexinernas fosforyleringstillstånd och av den extracellulära fettsyrasammansättningen.

Connexinuttrycket moduleras också. Hormoner kan upp- eller nedreglera connexininnehållet. I neonatala råtthjärtceller in vitro kan cAMP dramatiskt uppreglera Cx43-uttrycket med en samtidig ökning av aktionspotentialens ledningshastighet. Omfattningen av connexiner är anmärkningsvärt snabb. I det vuxna råtthjärtat är till exempel halveringstiden 1,3 timmar.7

Gap Junction Distribution in Normal Myocardium

I myokardiet uttrycks connexiner regionalt: Cx43 finns i hela hjärtat, möjligen med undantag för nodala vävnader och delar av konduktionssystemet.4 Hos däggdjur uttrycks Cx40 i förmaksvävnad (med undantag för råtthjärtat) och i det proximala konduktionssystemet (med undantag för marsvinshjärtat).89 Uttrycket av Cx45 tycks vara begränsat till nodala vävnader och konduktionssystemet,1011 men i vissa rapporter1213 hävdas en mycket mer omfattande spridning, troligen på grund av att man använt en inte helt specifik anti-Cx45-antikropp.14 Inga andra connexiner har hittills påvisats mellan kardiomyocyter.

I vuxna ventriklar innehåller gap junctions uteslutande Cx438 och är huvudsakligen lokaliserade i den interkalerade skivregionen (ID) mellan cellerna. De anisotropa ledningsegenskaperna hos det ventrikulära myokardiet är beroende av geometrin hos de sammankopplade cellerna och antalet, storleken och placeringen av gap junction plackerna mellan dem.15 Många (immuno)-histokemiska och (elektron)mikroskopiska studier har behandlat dessa frågor. Gap junction plaques består av matriser av mer eller mindre tätt packade 9-10 nm stora partiklar som representerar enskilda kanaler. Under normala förhållanden tycks gap junction plack hos råttor innehålla ≈15 % partikelfritt utrymme,16 medan kaninernas gap junction plack-partiklar är sammanhängande.17 När det gäller ledningsförmåga är det liten skillnad, eftersom det lägre antalet kanaler per kvadratmikrometer till stor del kompenseras av det minskade tillträdesmotståndet18 (se nedan). Den genomsnittliga arean av gap junction plack varierar från 0,21 μm2 i den mänskliga ventrikeln19 till ≈0,45 μm2 i råttans ventrikel2021 och till ≈4 μm2 i hundkammaren.22 I det senare fallet var denna area ≈1,5 μm2 för ungefär hälften av placken och ≈6,6 μm2 för den andra hälften. Av (elektron)mikroskopisk212223 och (immuno)histokemisk bedömning1921242526 framgår det att större gap junction plack är lokaliserade i interplicata regioner av ID (dvs. i regioner som löper mer eller mindre parallellt med cellernas långa axel) och att mindre plack är lokaliserade i plicata regioner. Hoyt et al22 uppskattade att 80 % av den totala gap junction-ytan per cell är belägen i interplicata regioner, där gap junctions kan tjäna både longitudinell och transversell konduktion.

Ventrikulära myocyter är anslutna genom ID till ≈10 grannceller.2226 Ledningshastigheten bestäms av gap junction plack-ytan i var och en av dessa ID. Den totala gap junction plackytan per ID är 47 till 94 μm2 hos råttor,27 42 eller 13,6 μm2 hos hundar,2223 och ≈10 μm2 hos människor.26

I förmaket innehåller gap junction plack både Cx43 och Cx40.913 Oftast lokaliseras Cx43 och Cx40 i samma plack utan att något av konnexinerna föredrar att vara lokaliserat i laterala cellgränser eller ID plack.9 Inga data finns tillgängliga för att beräkna gap junction plackytan per ID i förmaket.

I det ventrikulära myokardiet är uttrycket av Cx40 begränsat till konduktionssystemet.8 Hos de flesta däggdjursarter förekommer ingen Cx43 i den proximala delen (His-bunten, buntgrenar), medan Cx40 och Cx43 samuttrycks i de mer distala regionerna av buntgrenarna och Purkinjefibrerna.28 I Xenopus oocyter kan Cx43 och Cx40 inte bilda funktionella heterotypiska gap junction-kanaler,29 och det föreslogs att connexinfördelningen i det proximala konduktionssystemet skulle tjäna till att propagera aktionspotentialen snabbt till de distala delarna utan strömförlust via gap junctions till de omgivande septala myocyterna. I däggdjursceller verkar dock inkompatibiliteten mellan Cx40- och Cx43-connexoner vara mindre tydlig.30 I mushjärtan uttrycks Cx45 i hela den atrioventrikulära noden, His-bunten och buntgrenarna.10 Uttrycket av Cx40 är begränsat till kärnan av His-bunten och buntgrenarna.10

Distribution av gap junctions i sjukt myokard

I praktiskt taget alla hjärtsjukdomar som predisponerar för arytmier har förändringar i distributionen och antalet gap junctions (gap junction remodeling) rapporterats. Vid avancerad ischemisk sjukdom upptäcktes en smal zon bestående av ≈5 lager celler som gränsar till läkta hjärtinfarkter.24 I denna zon stördes den normala fördelningen av gap junctions i end-to-end-placerade ID:er med en förskjutning av Cx43-innehållande fläckar till de laterala cellgränserna utan förändringar i fläckstorlek. Normala, ischemiska och hypertrofiska mänskliga vänsterkamrar visade lika stora plaster av anti-Cx43-färgning, men den totala mängden Cx43 minskade med 40 % i de sjuka hjärtan.26 Antalet ID:er per cell skiljde sig inte åt i normala och sjuka hjärtan, vilket innebär att den cellulära geometrin inte hade förändrats dramatiskt. Å andra sidan, i reversibelt ischemiska och övervintrande mänskliga ventriklar observerades en minskning av Cx43-plackstorleken med 23 % respektive 33 % i de drabbade regionerna,19 utan några förändringar i det normala myokardiet. I dessa experiment observerades en förskjutning av Cx43-prickorna från ett läge vid ändan till ett lateralt läge; denna förskjutning rapporterades också vid hypertrofisk kardiomyopati.25

I en marsvinsmodell av kongestiv hjärtsvikt observerades en total minskning av Cx43 på 37 % i kongestiv hjärtsviktsstadiet efter 6 månaders aortabandning, medan inga förändringar sågs i det kompenserade hypertrofi-stadiet.31 Nyligen rapporterades32 en 35-procentig minskning av gap junction area per ID efter 4 veckors högerkammarhypertrofi orsakad av monokrotalininducerad pulmonell hypertension hos råttan, tillsammans med en 30-procentig minskning av den longitudinella ledningshastigheten (ΘL). Samtidigt uppträdde många Cx43-positiva fläckar längs cellernas sidogränser. Ledningshastigheten i tvärgående riktning (ΘT) och det totala Cx43-innehållet, bedömt genom immunoblotting, påverkades inte. Författarna drog slutsatsen att omfördelningen av gap junction plack kan förklara det minskade anisotropiförhållandet (ΘL/ΘT). Den observerade 55-procentiga ökningen av celldiametern kan dock också spela en roll. Peters et al33 visade en nära korrelation mellan inducerbarheten av figur-of-8 reentrantarytmier i epikardiell vävnad som gränsar till 4 dagar gamla infarkter i ventriklar från hundar och störningen av gap junction-fördelningen. Särskilt livskraftiga celler nära och ibland i interdigitering med nekrotiska celler i den infarkta regionen uppvisade omfattande Cx43-märkning av laterala cellgränser.

Det verkar som om lateralisering av gap junctions är ett framträdande kännetecken för sjukt myokard. Det är dock inte helt klart i vilken utsträckning denna lateralisering kan bidra till förändrade ledningsegenskaper, eftersom det nyligen visades34 att i ventrikelceller hos råttor som gränsar till läkta infarkter är många av de laterala gap junction plackarna lokaliserade i invaginationer av sarkolemma in i cellens inre, och bidrar därmed inte till kommunikation mellan cellerna. En jämförbar observation har gjorts vid högerkammarhypertrofi.32

Och även om kvantitativa data är sällsynta, är ett annat vanligt fynd i sjukt myokard en 30-40-procentig minskning av gap junction-ytan per ID. I (post)ischemiska ventriklar är denna minskning begränsad till några cellskikt runt det drabbade området, medan minskningen är mer utbredd i hypertrofiska ventriklar. Utifrån denna observation, enbart eller tillsammans med en ökad täthet av laterala gap junction plack, skulle man kunna förutsäga ett minskat anisotropiförhållande. I en studie23 har man föreslagit att ett ökat anisotropiförhållande ska förekomma i infarktgränszoner. Denna ökning berodde delvis på en minskning av den laterala (interplicata) gap junction-tätheten och delvis på en minskning av antalet celler som har sida-till-sida-förbindelser med grannceller.

Förändringar i gap junction-täthet och -fördelning i sjuk förmaksvävnad är mindre väldokumenterade. I snabbt paced hundförmak har en ökning av Cx43-positiva fläckar rapporterats,35 särskilt vid laterala cellgränser. I förmaket hos get hittades inga uppenbara förändringar i Cx43-täthet och -fördelning efter 16 veckors ihållande förmaksflimmer (AF),3637 även om en viss defosforylering hade skett. Cx40-protein saknades i 0,15-0,6 mm stora fläckar av förmaksvävnad efter 16 veckors AF utan minskning av Cx40 mRNA. Den fläckvisa minskningen av Cx40-protein var tydlig efter 2 veckors AF, ungefär samtidigt som AF blev ihållande. Huruvida denna minskning av Cx40 är kausalt relaterad till den bestående AF återstår att fastställa.

Data om inblandning av gap junction-remodellering i arytmier som har sitt ursprung i ledningssystemet eller i nodal vävnad har precis börjat rapporteras.383940

Gap junctions and Conduction Velocity

Effective gj

Vi utförde några enkla datorsimuleringar för att testa effekterna av förändringar i täthet och fördelning av gap junctions på aktionspotentialens ledningshastighet. Först bestämde vi den effektiva gap junction-konduktansen (gj, korrigerad för elektriska fälteffekter orsakade av cytoplasmatiskt accessmotstånd) med hjälp av vår tidigare publicerade modell18 och genom att anta att Cx43:s enkelkanals konduktans är 75 pS vid 37 °C41 och att alla kanaler är i sitt ledande tillstånd (men se referens 42 ). Figur 1A visar att effekterna av det cytoplasmatiska tillträdesmotståndet är uppenbara redan för relativt små gap junctions och att de blir mer framträdande med ökande gap junction-storlek. För gap junctions >0.5 μm2 är den effektiva konduktansen <50 % av det värde som erhålls genom att helt enkelt addera de individuella konduktanserna för alla kanaler i ett givet område (okorrigerad konduktans), och för klyftor >4 μm2 är den effektiva konduktansen till och med <20 %. Följaktligen är gj per ytenhet inte konstant utan minskar med ökande storlek på gap junctions (figur 1B). Den effektiva konduktansen är 0,3-0,5 μS/μm2 för små till måttligt stora gap junctions (0,3-1,5 μm2) och <0,2 μS/μm2 för stora gap junctions (>5 μm2). Som diskuterats ovan varierar gap junctions yta vanligen mellan 10 och 40 μm2 per ID. Om en genomsnittlig effektiv konduktans på 0,3 μS/μm2 används är den effektiva gj per ID mellan angränsande celler 3 till 12 μS.

Ledningshastighet

Nästan bedömde vi gj:s betydelse för ledningshastigheten. Vi stimulerade den vänstra cellen i en linjär sträng med 50 celler med en frekvens på 1 Hz och beräknade ledningshastigheten över den mellersta tredjedelen av strängen. Cellerna var antingen placerade ända mot ända eller sida vid sida, och angränsande celler var anslutna genom ett konstant (effektivt) gj (figur 2A). Vi använde den mänskliga ventrikelcellmodellen av Priebe och Beuckelmann43 i en numerisk representation av kabelekvationen som liknar den som Shaw och Rudy utforskat,44 med ett värde på 150 Ω cm för cytoplasmatisk resistivitet.45

För att erhålla ΘL-värden på ≈70 cm/s, som rapporterats för mänskliga ventriklar,46 krävs en konduktans på 7,0 μS (figur 2B). Detta stämmer väl överens med ovanstående värde på 3 till 12 μS som uppskattats från morfometriska data. Samma konduktans på 7,0 μS ger en ΘT på 30 cm/s. Under normala förhållanden är ΘL ganska okänslig för förändringar i gj: den minskar med endast 9 cm/s (13 %) när konduktansen halveras. ΘT är mer känslig för förändringar i gj: den minskar med 36 % om konduktansen halveras. Den relativa okänsligheten hos ΘL för förändringar i gj kan förklaras i termer av klyftans resistivitet, som vi beräknade från gj och celldimensionerna (figur 2C). För longitudinell ledning (heldragen linje med fyllda cirklar i figur 2C) sjunker klyftans resistivitet under cytoplasmisk resistivitet på 150 Ω cm (horisontell streckad linje) vid gj-värden som är så små som 2,5 μS, medan klyftans resistivitet för tvärgående ledning är mycket större än cytoplasmisk resistivitet vid alla gj-värden (streckad linje med öppna fyrkanter). Vi drar därför slutsatsen att ledningshastigheten, särskilt ΘL, endast är måttligt känslig för förändringar i den effektiva gj. Dessutom kan celldimensionerna (förhållandet mellan cellängd och cellbredd) spela en viktig roll när det gäller att bestämma (anisotropin hos) ledningshastigheten. Detta stämmer överens med slutsatsen från Spach et al47 att cellstorleken kan vara viktigare än gap junction-fördelningen.

Funktionella implikationer

Simuleringsresultaten utgör viktiga varningar för tolkningen av kvantitativa data från (immuno)histokemiska eller (elektron)mikroskopiska studier. En minskning av det totala gap junction-innehållet med så mycket som 40 % utan förändringar i gap junctionplackens storlek, som observerats i sjuka människohjärtan,26 kan i sig självt ha endast måttliga effekter på ledningshastigheten. Om det normala gj mellan cellerna är 5 μS resulterar en 40-procentig minskning till 3 μS i en 11-procentig minskning av ΘL från 65 till 58 cm/s och en 27-procentig minskning av ΘT från 24 till 18 cm/s (figur 2B). Det tillhörande anisotropikvoten ökar med 22 % från 2,7 till 3,3. I andra fall förblev det totala gap junction-innehållet oförändrat, men en förskjutning till laterala cellgränser inträffade.2532 En 40-procentig förskjutning skulle minska ΘL med 11 % och öka ΘT med 25 %, vilket skulle resultera i en 29-procentig minskning av anisotropikvoten. Om de nya laterala gap junctions är lokaliserade intracellulärt,3234 förändras ΘT kanske inte alls.

Slutord

I många studier som involverar remodellering av gap junctions i sjuk ventrikelvävnad har författarna dragit slutsatsen att en minskad ledningshastighet kan öka benägenheten för reentranta arytmier. Den nuvarande analysen av de begränsade data som finns tillgängliga tyder dock på att minskningen av ledningshastigheten eller förändringarna i anisotropiförhållandet i själva verket kan vara måttliga. De observerade förändringarna skulle definitivt inte föra substratet till området för långsam ledning, vilket tas upp i flera nyligen genomförda experimentella484950 och teoretiska4451 studier. Vår analys tyder på att cytoplasmatisk resistivitet och cellulär geometri är mycket viktigare än vad man vanligtvis inser, en slutsats som också förespråkas av Spach och kollegor.15475253

Vi införlivade inte sjukdomsinducerade förändringar i membranets jon- och gap junction-kanalegenskaper i vår analys. Utan tvekan komplicerar sådana patofysiologiska förändringar ytterligare förståelsen av arytmogenesen vid akut ischemi, kronisk hjärtinfarkt, hypertrofi och hjärtsvikt.

Fotnoter