Alpha-synuclein é uma proteína que modula a reparação do ADN com implicações nas doenças do corpo de Lewy

Humans

E tecido do sujeito humano foi obtido através do Oregon Alzheimer’s Disease Center (ADC) e do Departamento de Patologia da OHSU e os sujeitos afectados estabeleceram diagnósticos clínicos e patológicos (Demência com corpos de Lewy Bodies). O uso de tecidos foi aprovado pelo IRB na OHSU e realizado de acordo com as diretrizes relevantes. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes e/ou seus representantes legais.

Animais

Animais foram alojados pelo Departamento de Medicina Comparada da OHSU em um ciclo luz-escuro e vivário com temperatura e umidade controladas e mantidos sob dieta alimentar e hídrica ad libitum. Todos os experimentos foram aprovados pelo IACUC da OHSU, todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes, e todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados e seu sofrimento.

Geração do modelo de rato

Linhas de rato transgénicas

Utilizando o OHSU Transgenic Mouse Model Core, criámos um rato expressando a alfa-sinucleína humana fundida a GFP (C-terminal tag) melhorada contendo uma mutação pontual em Alanine 53 (GCA > ACA) causando uma mudança de aminoácidos threonine (A53T Syn-GFP). A sequência A53T-Syn-GFP foi clonada no vetor MoPrp.Xho (presente de David Borchelt)74 no site XhoI. A expressão está sob controle transcripcional do promotor da proteína do prião do rato. A sequência de 30 bp do linker entre A53T Syn e GFP é GGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC, que se traduz para GlyThrAlaGlyProGlySerIleAlaThr. Esta linha do mouse mostra a expressão A53T Syn-GFP em >90% dos neurônios corticais e <10% dos astrocitos (A.J.S. e V.K.U., dados não publicados). 142E Ratos transgénicos Syn-GFP32,33,39,75 e 142E Linhas de rato Syn-GFP/mouse mSynKO foram obtidas dos criadores da linha, Edward Rockenstein e Eliezer Masliah. Ratos transgénicos TdTomato-NLS localizados a nível nuclear foram obtidos dos Laboratórios Jackson (stock# 023035). Animais de knock-out alfa-synuclein e ratos de controle apropriados foram obtidos dos Laboratórios Jackson (estoque# 016123, 005304).

AAV8 virus generation

Criamos construções virais de A53T Syn-GFP contendo mutações pontuais em alfa-sinucleína na serina-129 causando ou uma alanina (TCT > GCT) ou ácido aspártico (TCT > GAT) mudança de aminoácidos (constrói presente de Pamela McLean). Estes construtos foram clonados no auto-complementar AAV8 vetor viral pTRS-KS/CBh-GFP (do National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, IN), sob controle transcripcional do promotor CBh (Chicken Beta Actin Short), utilizando os sites de restrição enzimática AgeI e ApaI. A sequência de 30 bp linker entre alpha-Syn & enhanced GFP é GGTACCGCGGGCCCGGGATCCATCGGCCACC. Os vírus finais scAAV8-CBh-A53T-S129A-Syn-GFP e scAAV8-CBh-A53T-S129D-Syn-GFP foram feitos pelo Gene Transfer Vector Core na Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Boston, MA.

Injeções virais intraventriculares AAV8

ICV em neonatos P0 foram feitas seguindo o protocolo de mão livre76. Injetamos 2 µL de vírus não diluído em cada ventrículo lateral em títulos de ~1E12 cópias genômicas por mililitro. O único desvio deste protocolo publicado é que não diluímos o vírus em azul tripano.

Indução da patologia do rato Lewy

2 a 3 meses de idade masculina foram injetados ratos com a seqüência PFF do rato WT de acordo com nossos protocolos previamente publicados25. 2,5 μl (2 mg/ml) PFFs recém-sonerados ou 2,5 μl PBS foi injetada no córtex sensorial-motor primário do hemisfério direito em isoflurano (1% a 2%)-animais anestesiados e retornou à sua gaiola domiciliar. Foram sacrificados e preparados para IHC como descrito abaixo após intervalo pós-injeção de 3-6 meses (6-9 meses de idade).

Mouse brain in vivo imaging & analysis

Cranial window surgery and imaging was done using the same protocol as we have previously published25,39 in isoflurane anesthetized animals, usando um microscópio Zeiss LSM 7MP multifotão multifotão equipado com detectores BiG de canal duplo (GaAsP binário) e uma Coherent Technologies Camaleão titanium-sapphire femtosecond pulsado fonte laser (sintonizado a 860 nm para imagens Syn-GFP). Foi utilizado um software de aquisição de imagem Zeiss Zen 2011. Para experimentos com danos induzidos por laser nuclear (LID), a função Branqueamento em Zen foi usada para iluminar regiões pequenas e submicronizadas dentro do núcleo com laser Camaleão afinado a ~730 nm para <1 ms). Há um atraso de ~4 segundos para mudar o laser de e para o LID (~730 nm) de comprimento de onda. Em um subconjunto de experimentos, foram gerados animais que expressaram Syn-GFP simultaneamente com o TdTomato-NLS nuclear localizado. Estes demonstraram que a localização do pulso LID para regiões >2 μm a partir da periferia da célula foram sempre posicionados dentro do núcleo. Este critério foi utilizado para localizar o pulso LID dentro dos núcleos de Syn-GFP expressando os neurônios corticais in vivo. As imagens LID foram analisadas com ImageJ de forma semelhante aos nossos experimentos FRAP previamente descritos25,39. As regiões de interesse (ROIs) foram selecionadas para obter valores médios de fluorescência na DIL e ROIs de controle dentro do núcleo. A razão do sinal em cada ponto de tempo da DIL versus as ROIs de controle foi usada para calcular a Razão de Enriquecimento. Para experimentos com FRAP após a DIL, foi utilizado um protocolo de fotobleaching e análise similar ao nosso trabalho publicado anteriormente25,39. Os dados foram analisados no Prism 6 (GraphPad) para obtenção de ajustes exponenciais únicos para o curso do tempo de recuperação e para as frações imóvel e móvel. Todos os animais utilizados foram de 5 a 9 meses de idade.

Culturas de neurônios corticais do rato e imagens

Ratos C57/BL6 foram utilizados para gerar culturas neuronais primárias isoladas de ratos embrionários, com base nos métodos de Kaech e Banker77, e adaptados de Gray e colegas78. Em resumo, os embriões foram colhidos aos 18 dias de gestação de fêmeas anestesiadas. O córtex foi dissecado, suavemente picado e tripsinizado para gerar suspensões de neurônios dispersos. Neurônios corticais recém isolados foram eletroporados com plasmídeos codificando duas construções alfa-sinucleares humanas marcadas com uma GFP melhorada (scAAV-huSyn_s129A:EGFP, scAAV-hySyn_s129D:EGFP). 330.000 neurônios corticais eletroporados de cada construção foram revestidos em pratos contendo lamelas revestidas de poli-lisina em meio MEM (GIBCO/Life Technologies), 5% FBS (Atlanta Biologicals) e 0,6% de glicose (Sigma-Aldrich). Após 4 hrs, o meio foi removido e substituído por meio Neurobasal suplementado com 1 × GlutaMAX (GIBCO/Life Technologies) e 1× GS21 (MTI-GlobalStem). Cada prato era alimentado semanalmente com 0,5 ml de meio Neurobasal mais GlutaMAX e GS21, com a primeira ração (aos 5 dias in vitro (DIV)) contendo AraC. Após 7 DIV, as lamelas dos neurônios cultivados de cada construção foram imitadas usando um sistema de células vivas com uma câmara de imagem fechada. Os experimentos com LID nuclear de cultura de células foram realizados na mesma plataforma de imagem usando os mesmos protocolos de imagem e análise que nossos experimentos com LID nuclear in vivo descritos acima.

Culturas hipocampais de camundongos &Semeadura de PFF

Culturas hipocampais de camundongos e semeadura de PFF induzida por Lewy patology foi realizada usando nossas técnicas previamente descritas79,80. Em resumo, as culturas neuronais primárias foram preparadas a partir do E16-E18 CD1 (Rio Charles). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia do NIH para Cuidados e Uso de Animais Experimentais e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Pensilvânia. Os neurônios hipocampais dissociados foram revestidos com lamelas revestidas de poly-D-lysine (Carolina Biological Supply) a uma densidade de ~50.000 células/cm2. PFFs alfa-sinucleares humanos recombinantes portadores da mutação patogênica S87N81 foram diluídos em PBS a 0,1 mg/mL, sonicados e diluídos em meio neuronal. Os neurônios foram tratados a 5 ug/ml no DIV 7 e incubados por 12 dias. As células foram fixadas em PFA a 4%/4% de sacarose por 15 min à temperatura ambiente e depois permeabilizadas em 0,3% Tx-100 e bloqueadas por 1 hora à temperatura ambiente em 3% FBS/3% BSA. Anticorpos primários (clone anti-α-Synuclein PhosphoSer129 81 A, diluição 1:2000, Biolegend cat#825701; clone anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) JBW301, diluição 1:500, Millipore cat#05-636) foram diluídos no tampão de bloqueio e incubados à temperatura ambiente durante 3 horas. As lamelas foram então lavadas com PBS 3 vezes e incubadas com os anticorpos secundários rotulados como fluor Alexa-adequado. As lamelas lavadas foram montadas em lâminas usando Fluoromount-G com DAPI (Fisher Scientific).

Anticorpos secundários: Alexa 488, Goat anti rato IgG2a, diluição 1:1000, Fisher Scientific; Alexa 594, Goat anti rato IgG1, diluição 1:1000, Fisher Scientific.

Uma lâmina de PE Scanner foi usada para a imagem das lamelas. O software HALO (Indica Labs) foi usado para contar γH2AX focos e núcleos corados com DAPI localizados a 1,5 mm da borda de cada lamela. A análise estatística dos dados foi feita utilizando o Graphpad Prism Versão 4.

Immunofluorescência & análise

Células HAP1

Hap1 controlo parental WT (item #C631 lote 29663) e Hap1 Human SNCA 103 bp eliminação eliminatória (item #HZGHC003210c003 lote 2) as linhas de células foram obtidas a partir do Horizon Discovery e cultivadas em suportes IMDM (Gibco# 11995-065) + 10% Soro Bovino Fetal + Pen-Strep e cultivado numa incubadora humidificada a 37 C com 5% de CO2. As células foram semeadas em lamelas revestidas com PLL #1,5 em pratos de 35 mm um dia antes da fixação e cresceram até ~80% de confluência. As células foram fixadas em PFA 4% em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente (RT), lavadas 1x em PBS e armazenadas a 4 C em PBS até o procedimento de coloração. As células fixas foram permeabilizadas com 1 mL de PBS + 0,25% de Triton-X 100 agitando suavemente à RT durante 20 minutos. A solução foi removida e as células foram bloqueadas por 20 minutos em 1 mL de tampão de bloqueio (0,1% de Triton-X 100 10% de soro normal de cabra em PBS). Os anticorpos primários foram diluídos em tampão de incubação (diluição 1:5 do tampão de bloqueio em PBS) e incubados durante a noite em RT com agitação suave. No dia seguinte, as células foram lavadas 3x em PBS durante 15 minutos. Os anticorpos secundários complementares fluorescentes foram diluídos 1:1000 em Tampão de Incubação, adicionados às células, e incubados em RT, no escuro durante a noite, com agitação suave. No dia seguinte, as células foram lavadas 3x em PBS por 20 minutos. A coloração nuclear foi feita imediatamente antes da lavagem final com PBS com 2,5ug/mL DAPI (Sigma D9542) em PBS durante 20 minutos. Antes da montagem, as células foram lavadas brevemente em H2O desionizada. As lamelas foram montadas com 13 µL de CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution e seladas com Biotium CoverGrip Coverslip Sealant. As lâminas foram imersas em um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss Elyra PS.1 710 com software Zen. Foram obtidos passos em Z de 0,5 µm a 63x zoom1, com cuidado para nunca saturar o sinal de anticorpos dentro do núcleo.

Anticorpos primários utilizados foram: anti-Syn1, diluição 1:500, monoclonal de rato, BD Biosciences, cat. 610786; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer clone 10 H, diluição 1:500, policlonal de galinha, Tulip BioLabs, cat. 1023; anti-Fosfo-Histone H2A.X, diluição 1:500, monoclonal de coelho, Cell Signaling, cat. 9718; anti-fosfoS129-Syn EP1536Y, diluição 1:500, monoclonal de coelho, Abcam, ab51253; anti-fosfoS129-Syn 81 A, 1:667diluição monoclonal de rato, Covance, cat. 825701; anti-Syn 4B12, diluição 1:500, monoclonal de rato, Biolegend, cat. 807804; e anti-Syn EPR20535,1:100 diluição, monoclonal de coelho, Abcam, ab212184. Os anticorpos secundários utilizados foram: Alexa Fluor 647 anti-coelho caprino, ThermoFisher cat.A-21245; Alexa Fluor 555 anti- rato caprino, Abcam ab150114; Alexa Fluor 488 burro anti-coelho, Jackson ImmunoResearch cat.703-545-155.

tratamento com cleomicina ICC: Sulfato de bleomicina (Selleckchem, cat. S1214) em pó foi diluído em H2O para fazer uma solução de reserva de 10 mg/mL, aliquotada e armazenada a -80C. Um dia antes do tratamento as células Hap1 WT e Hap1 SNCA KO foram semeadas em lamelas revestidas de PLL #1,5 em pratos de 35 mm para serem ~80% confluentes no dia seguinte. No dia do tratamento, os meios normais foram removidos e 2 mL de meios quentes frescos contendo 10ug/mL de Bleomicina foram adicionados a cada prato. As células Sham tinham meios quentes frescos, sem Bleomicina, adicionados a cada prato. As células foram colocadas numa incubadora humidificada durante 1 h a 37 C com 5% de CO2. Após o tratamento, a mídia foi removida e as células foram fixadas em PFA 4% em PBS por 10 minutos em RT, lavadas 1x em PBS e armazenadas a 4 C em PBS até o procedimento de coloração.

Tratamento com Bleomicina Western Blot: Um dia antes do tratamento, células Hap1 WT e Hap1 SNCA KO foram semeadas em placas de 2 × 10 cm por condição para serem ~80% confluentes no dia seguinte. O tratamento com bleomicina foi feito da mesma forma que com ICC. Após o tratamento, os meios foram removidos e as células foram lavadas 1x com PBS quente. As células foram colhidas por tripsinização e coletadas em tubos cônicos de 15 mL peletizados por 5 min 200rcf. O líquido foi aspirado, os pellets foram ressuspensos em 2 mL de PBS e transferidos para tubos de microcentrífuga de 2 × 2 mL. As proteínas foram extraídas em frações citosólicas e nucleares usando o kit de extração NE-PER (Thermo-Fisher, cat. 78833) de acordo com as recomendações do fabricante com a adição de uma breve sonificação (10 segundos, 10 kHz) após a primeira etapa de ressuspensão nuclear. As preparações proteicas foram armazenadas a -80C até a análise Western blot.

Para imagens confocais, foram adquiridas imagens em um microscópio confocal Zeiss Elyra PS.1 com uma objetiva de óleo Plan-Apochromat 63x/1.40. Toda a análise de colocalização foi feita usando o software ImageJ (NIH), criando ROIs para cada núcleo a partir de uma única imagem localizada no meio do núcleo na direção z. O plugin CoLoc 2 foi usado para medir o coeficiente de Pearson entre os sinais e o valor de fundo esperado após a tradução aleatória de um canal versus o outro.

Cérebro de rato

Cérebro de rato masculino (3-6 meses de idade) foram dissecados imediatamente após a morte, colocados em 6 mL de PFA fresco de 4% em PBS, e fixados com um Pelco Biowave Pro durante 90 minutos a 150 W num banho de água em circulação. Os cérebros foram movidos a 4 °C para continuar a fixar durante a noite. No dia seguinte, o PFA foi substituído por azida sódica a 0,05% e armazenado a 4 °C até o processamento posterior.

Após a fixação, os cérebros foram cortados em seções coronal ou sagital flutuante de 50 µm usando um Vibratome Leica VT1000S. Para certos anticorpos, a recuperação de epitopos induzidos pelo calor (HIER) foi necessária antes do bloqueio. O corte do cérebro foi adicionado a um tubo contendo tampão HIER (1 mM EDTA, 10 mM Tris Base, 0,05% Tween, pH = 8.5), cozido a vapor durante 20 min, e arrefecido à temperatura ambiente durante 20 min. O tecido foi bloqueado durante 1 hora em tampão de bloqueio (0,1% Triton-X, 10% soro de cabra, em PBS). O anticorpo primário foi diluído em tampão de incubação (diluição 1:5 do tampão de bloqueio) a uma concentração optimizada para cada anticorpo e incubado de um dia para o outro, no escuro, agitando à temperatura ambiente. O tecido foi lavado durante 30 min. com PBS 5 vezes. O anticorpo secundário complementar foi diluído em tampão de incubação e incubado de forma semelhante durante a noite, à temperatura ambiente. No dia seguinte, o tecido foi lavado com 5 trocas de PBS. A coloração com DAPI foi feita imediatamente antes da lavagem final. O tecido foi montado em uma lâmina no CitiFluor CFMR2 Antifadente Solution. Uma lamela número 1,5 foi selada sobre o tecido com Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Anticorpos primários utilizados foram: anti-α-Synuclein Phospho (Ser129) Clone anticorpo 81 A, monoclonal de rato, diluição 1:667, Biolegend cat#825701; anticorpo anti-alfa Synuclein (phospho S129) , monoclonal de coelho, diluição 1:500, Abcam cat#ab51253; Anti-asyn (Syn1/mSyn), monoclonal de rato, 1:500 diluição, BD Biosciences cat#610786; Anti-pan-ADP-ribose binding reagent, coelho, diluição 1:1000, Millipore cat#MABE1016; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer, clone 10 H (PADPR), galinha, diluição 1:100, Tulip BioLabs cat#1023; Anti-fosfo-Histone H2A.X (Ser139) Clone de anticorpos JBW301, rato, diluição 1:500, Millipore cat#05-636; Anti-fosfo-Histone H2A.X (Ser139) Clone de anticorpos 20E3, monoclonal de coelho, diluição 1:500, Cell Signaling cat#9718 Foram usados anticorpos secundários: Alexa 647, anti-coelho de cabra, diluição 1:1000, Invitrogen cat#MPA21245; Alexa 647, anti-rato de cabra, diluição 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, anti-coelho de cabra, 1:diluição 1000, Abcam cat#ab150078; Alexa 555, anti-rato de cabra, diluição 1:1000, Abcam cat#ab150114; Alexa 488, anti-gato de cabra diluição 1:1000, Abcam cat#ab150169.

Para imagens confocais, as imagens foram adquiridas em um Zeiss Elyra PS.1 microscópio confocal com uma objetiva de óleo Plan-Apochromat 63x/1.40. Foram usadas potências de laser de 1-5% para adquirir z-stacks através de 2-4 regiões de córtex por secção de tecido. O software de imagem Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) foi usado para analisar os dados do IHC. A fim de segmentar o núcleo a partir do citoplasma, uma superfície foi criada usando o canal DAPI. Apenas núcleos neuronais inteiros foram analisados. Informações estatísticas (intensidade média, intensidade da soma, número total de superfícies) para cada canal foram exportadas e analisadas posteriormente no Prism 6 (GraphPad). Para análise dos focos dentro dos núcleos, o sinal nuclear do canal de escolha foi mascarado usando uma superfície nuclear criada a partir do canal DAPI. A partir do sinal nuclear do canal mascarado desejado, foram feitas superfícies para quantificar focos nucleares.

Cérebro humano

Seções da amígdala da Demência humana com casos de autópsia de Lewy Body foram recuperados imediatamente na autópsia (intervalo post-mortem 12-48 horas), colocados em 6 mL de PFA fresco de 4% em PBS, e fixados com um Pelco Biowave Pro por 90 minutos a 150 W em um banho de água em circulação. As secções foram movidas para 4 °C para continuar a fixar durante a noite. No dia seguinte o PFA foi substituído por azida sódica a 0,05% e armazenado a 4 °C até processamento posterior.

Após a fixação, as seções amígdala foram cortadas em seções flutuantes de 50 µm usando um Vibratome Leica VT1000S. O tecido foi bloqueado por 1 hora em tampão de bloqueio (0,1% Triton-X, 10% soro de cabra, em PBS). O anticorpo primário foi diluído em tampão de incubação (diluição 1:5 do tampão de bloqueio) a uma concentração optimizada para cada anticorpo (ver abaixo) e incubado de um dia para o outro, no escuro, enquanto tremia à temperatura ambiente. O tecido foi lavado durante 60 min. com PBS 5 vezes. O anticorpo secundário complementar foi diluído em tampão de incubação e incubado de forma semelhante durante a noite, à temperatura ambiente. No dia seguinte, o tecido foi lavado com 5 trocas de PBS. A coloração com DAPI foi feita imediatamente antes da lavagem final. O tecido foi montado em uma lâmina no CitiFluor CFMR2 Antifadente Solution. Uma lamela #1.5 foi selada sobre o tecido com Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Anticorpos primários utilizados foram: anti-α-Synuclein Phospho (Ser129) Clone de anticorpos 81 A, monoclonal de rato, diluição 1:667, Biolegend cat#825701; Anti-fosfo-Histone H2A.X (Ser139) Clone de anticorpos 20E3, monoclonal de coelho, diluição 1:500, Cell Signaling cat#9718. Anticorpos secundários utilizados foram: Alexa 647, anti-rato de cabra, diluição 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 488, anti-coelho de cabra, diluição 1:1000, Abcam cat#ab150077.

Imagens foram capturadas num Zeiss LSM 880 com microscópio Airyscan. Para determinar os sinais específicos de anticorpos do aumento da coloração de fundo autofluorescente nas amostras de tecido humano, foi utilizado um protocolo de desmistura linear. O modo Lambda foi usado para definir parâmetros para a objetiva, lasers e dicróicos, conforme necessário para a imagem da amostra multicolorida. Usando os mesmos parâmetros, foram criados espectros de referência individuais a partir de amostras coloridas de uma única cor. Além disso, uma amostra não manchada foi usada para determinar os espectros de referência de fundo. Todos os resíduos foram minimizados ao criar os espectros de referência. A amostra multicolorida foi então imersa, especificando os espectros de fundo e de cor única relevantes, e não misturada usando o software Zeiss Zen.

Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) software de imagem foi usado para analisar os dados IHC. A fim de segmentar o núcleo do citoplasma, uma superfície foi criada usando o canal DAPI. Somente núcleos neuronais inteiros foram analisados. Informações estatísticas (intensidade média, intensidade da soma, número total de superfícies) para cada canal foram exportadas e analisadas posteriormente no Prism 6 (GraphPad). Para análise dos focos dentro dos núcleos, o sinal nuclear do canal de escolha foi mascarado usando uma superfície nuclear criada a partir do canal DAPI. A partir do sinal nuclear do canal mascarado desejado, foram feitas superfícies para quantificar focos nucleares.

HAP1 ensaio de cometa celular

HAP1 ensaio de cometa celular neutro foram realizados de acordo com as recomendações de Trevigen (Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K). As suspensões celulares (2 × 104 células/ml) em IMDM sem soro (Sigma) misturado a uma relação 1:2 com Comet LMAgarose (Trevigen) foram pipetadas em CometSlidesTM (Trevigen) e colocadas a 4 °C durante 10-15 min para o molde. As lâminas foram incubadas durante a noite em Lysis Solution (Trevigen) a 4 °C no escuro. e depois em tampão de eletroforese neutro (300 mM de acetato de sódio, 100 mM de Tris-HCl, pH 9) durante 1 hr a 4 °C no escuro. As lâminas foram eletroforescidas em tampão fresco por 40 min a 20 V (1 V/cm) a 4 °C. Após a eletroforese, as lâminas foram incubadas primeiro em tampão de precipitação de DNA (1 M de acetato de amônio, 86,6% EtOH), e depois 70% EtOH à temperatura ambiente no escuro, durante 30 min cada e secas a 37 C. As lâminas foram coradas com 1X SYBRTMgreen (Invirogen) em 1X PBS (Gibco) à temperatura ambiente durante 30 min no escuro, mergulhadas em dH2O 10 vezes para lavar o excesso de corante, e secas a 37 °C. Os cometas foram visualizados em um Apotome Zeiss usando uma lente 10X e pontuados usando CometScoreTM.

Tratamento de bleomicina Comet Assay: Um dia antes do tratamento, células Hap1 WT e Hap1 SNCA KO foram semeadas em placas de 2 × 35 mm por condição para serem ~80% confluentes no dia seguinte. Os protocolos de tratamento com Bleomicina e Sham foram feitos da mesma forma que para o ICC. Após o tratamento, a mídia foi removida e as células foram lavadas 1x com PBS quente. Se se seguiu um período de recuperação, então foram adicionados meios quentes frescos e as células foram colocadas de volta na incubadora. As células foram colhidas por tripsinização com 0,05% de Tripsin-EDTA (Gibco cat. 15400-54). As células tripsinizadas de placas de 2 × 35 mm foram recolhidas em tubos cónicos de 15 mL e granuladas durante 5 min 200rcf. O líquido foi aspirado, as pastilhas foram ressuspendidas em meio fresco de 250uL sem FBS ou Penn-Strep, transferidas para um tubo de microcentrifugação de 2 mL e armazenadas em gelo até ao uso no ensaio Comet como descrito acima.

Ensaio de cometa de tecido cerebral do rato

Tecido cerebral extraído friamente de ratos (com 1, 3, 6-9 meses de idade) foi finamente cortado com uma lâmina de barbear e suspenso em PBS gelado (sem Ca2+ e Mg2+) e homogeneizado por 30 segundos usando um homogeneizador manual. O tecido foi microcentrífugo durante um minuto e o sobrenadante diluído 1:10 em PBS. As células foram contadas usando um hemocitômetro e diluídas a 1 × 105/ml. As células diluídas foram combinadas com Agarose de baixa fusão (LM) na proporção 1:2 (v/v) e espalhadas sobre o poço da lâmina do cometa de vidro (kit de ensaio do cometa Trevigen, cat#4250-050-K). As lâminas foram secas no escuro a 4 °C durante 15 minutos e colocadas no kit solução de lise a 4 °C durante a noite. O excesso de tampão foi drenado das lâminas antes da imersão em 50 mL TBE, pH 7,4, durante 30 min a 4 °C. As lâminas foram submetidas a eletroforese em TBE, pH 7,4, a 20 V, durante 40 minutos a 4 °C. O excesso de TBE foi drenado e as lâminas foram colocadas em dH2O duas vezes durante 5 min. As lâminas foram então colocadas em 70% EtOH durante 5 min e secas a 37 °C durante 15 min. 100 µl de 1X SYBR-Green foram pipetadas em cada círculo de agarose seca e as amostras foram coradas durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. O excesso de solução SYBR-Green foi retirado e as lâminas foram lavadas em dH2O várias vezes. As lâminas foram deixadas a secar completamente a 37 °C e armazenadas a 4 °C. Os cometas foram visualizados em um microscópio Zeiss ApoTome sob uma objetiva 10X e pontuados usando o software CometScore™ (TriTek).

Electrophoretic mobility shift assay

DNA preparation

300 bp fragmentos foram extraídos de uma escada de 100 bp (NEB) separados em um gel de agarose a 1% a 175 V por 2 horas em RT usando o QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). O DNA foi limpo usando o DNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research), e eluído em 1X TE. A concentração final e pureza do DNA foram determinadas por Nanodrop.

Electrophoretic mobility shift assay

DNA fragmentos (20 ng) foram misturados com hu_ser129_phospho-syn recombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg, e 16 µg; Proteos, Inc.), hu_α-synuclein recombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg e 16 µg; Proteos, Inc.) ou glutationa S-transferase recombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg e 16 µg; GenScript) numa reacção de 20 μL contendo 94 mM Tris-Cl, pH 8.0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, e 5% ficoll no gelo durante 20 min, depois temperatura ambiente durante 30 min. Após a adição de 2 µL 10X Orange Loading Buffer (Licor), 8 μL de reação total foram carregados em um gel de poliacrilamida TBE (Novex) 10% ou 6% e rodam a 100 V durante 2 horas em RT. Os géis foram corados durante 30 minutos com mancha de ADN seguro 10X SYBRTM (Invitrogen) em 1X TBE. As imagens foram obtidas usando o sistema de imagem Fluorchem M e quantificadas usando ImageJ Gel Analyzing tool.

Western blot

10% de poliacrilamida TBE géis foram transferidos para um Biodyne™ B Nylon Membrane (Thermofisher Scientific) a 30 V por 1 hora e 16 min em gelo em 0,5X TBE usando o sistema Novex XCell II Blotting System (Invitrogen). As membranas foram bloqueadas durante a noite no tampão bloqueador Odyssey PBS (Li-Cor) e coradas durante 1 hora em RT com Syn1 (1:1.000; Biolegend) e durante a noite a 4 °C com IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG (1:10.000; Li-Cor). As imagens foram adquiridas usando Li-Cor Odyssey CLx Imaging System.

Western Blot for Hap1 Nuclear protein preps: As concentrações do preparo de proteína nuclear e citoplasmática NE-PER Hap1 foram quantificadas utilizando o kit de ensaio de proteína Pierce BCA (Pierce, cat. 23225) e lidas em um Microfotômetro Multiskan FC (Fisher, cat. 51119000) com uma leitura de 550 nm. 5 µg & 10 µg de proteína nuclear foi diluído em tampão de amostra SDS (Novex, cat. LC2676) + BME (Gibco, cat. 21985-023) e carregado num gel Tris-Glycine 10-20% (Novex, cat. XP10202BOX). 3 µL de escada de proteína de cor preservada (NEB, cat. P7719) foi carregada para referência. O gel foi executado usando o Novex Xcell Blotting System no SDS running buffer (Novex, cat. LC2675) durante 70 min a 120 V. O gel foi desmontado e configurado para transferência para uma membrana PVDF Immobilon-FL (Millipore, cat. IPF00010). O gel foi transferido em tampão de transferência Tris-Glycine (Novex, cat. LC3675) sobre gelo durante 2hrs a 25 V. Após a transferência, a membrana foi removida e imediatamente fixada em 4% PFA + 0,01% de Glutaraldeído durante 10 minutos com agitação suave a RT. A membrana foi lavada 1x em milliQ H2O e corada com o kit de coloração de proteína total REVERT (LI-COR, cat. 926-11010) de acordo com o protocolo do fabricante. A proteína total corada foi adquirida usando o LI-COR Odyssey CLx Imager. Após a reversão da coloração REVERT, a membrana foi lavada 1x em milliQ H2O e bloqueada em Odyssey Blocking Buffer (LI-COR, cat. 927-40000) durante a noite a 4 C com agitação suave. Os anticorpos primários foram diluídos 1:1000 em Tampão de Bloqueio e incubados durante 2 horas em RT com agitação suave. A membrana foi lavada 3x em 0,1% de Tween20 em PBS durante 10 min. Anticorpos secundários (LI-COR IR680LT burro gato anti-coelho. 926-68023; IR800CW burro gato anti-rato. 926-32212) foram diluídos 1:10000 em tampão de bloqueio e incubados durante 1 h em RT com agitação suave. A membrana foi lavada 3x em 0,1% Tween20 em PBS durante 10 min e 1x em PBS durante 10 min, em RT. As imagens foram adquiridas utilizando o LI-COR Odyssey CLx Imager. A análise foi feita na FIJI utilizando o analisador de gel. O sinal de anticorpos foi normalizado para REVERT proteína total.

T4 ensaio de junção final de ADN mediado por ligas

Cada reacção de junção final contém 150 ng de um produto PCR de ADN de 1,2 kb digerido nas extremidades de 5′ e 3′ com a enzima de restrição final coesiva XhoI (NEB RO146S). As reacções são realizadas em 20 µL de volume de reacção contendo 150 ng de ADN digerido, 2,8 µL de tampão proteico (10 mM Tris, 50 mM NaCl pH = 7,6), 5,3 µL de glicerol a 20% em PBS + Mg + Ca, 2 µL de tampão T4 ligase, 200 ng ou 40,5 ng de proteína, 25U de T4 ligase (NEB M0202), e H2O estéril a volume. Todos os componentes excepto a ligase T4 foram combinados e incubados em gelo durante 15 min. 25U de ligase T4 foram adicionados à reacção e incubados em RT durante 90 min. Após a incubação, a reacção foi imediatamente limpa com uma coluna Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research) e eluídas em 15 µL de H2O estéril. O SybrGreen e o tampão de carga foram adicionados ao ADN e as amostras foram electroforescidas num gel TAE de agarose a 1% durante 1 hora a 135 V e imergidas num gerador de imagens de quimioluminescência e fluorescência Syngene G:BOX. ImageJ foi usado para analisar a imagem do gel e os dados foram obtidos usando Prism 6 (GraphPad).

Desenho experimental & análise estatística

Todos os valores quantificados são relatados como a média ± SEM. O tipo e número da amostra relevante (N) e os testes estatísticos usados para avaliar a significância para cada experimento são apresentados com cada conjunto de dados. Os tamanhos de amostra utilizados em cada experimento foram baseados em estimativas de tamanhos de efeito esperados (~10-50%) e desvios padrão dos dados preliminares e foram energizados para detectar diferenças com nível de significância de 0,05 (α) e potência de 0,9 (1-β).