Macchio begann im Alter von 3 Jahren mit Stepptanzunterricht und wurde im Alter von 16 Jahren von einem Talentagenten entdeckt. Daraufhin wurde er für die Rolle des Jeremy Andretti in der Fernsehserie Eight Is Enough gecastet. Nach dem Ende von Eight is Enough bekam er 1983 die Rolle des Johnny Cade in dem Film The Outsiders. Diese Rolle führte dazu, dass er 1984 die Rolle des Daniel LaRusso in dem Film The Karate Kid und zwei seiner Fortsetzungen, The Karate Kid Part II und The Karate Kid Part III, übernahm. 1986 trat Macchio in dem Film Crossroads auf, in dem er den Musikstudenten Eugene Martone darstellte. Ebenfalls 1986 spielte Macchio in Cuba and His Teddy Bear am Broadway an der Seite von Robert DeNiro. 1992 spielte er an der Seite von Joe Pesci und Marisa Tomei in der Erfolgskomödie My Cousin Vinny die Rolle des Billy Gambini, der auf der Durchreise durch eine Kleinstadt in Alabama zu Unrecht des Mordes beschuldigt wird. 1996 spielte Macchio die Hauptrolle des J. Pierrepont Finch in der Wiederaufnahme der US-Tournee des 1962 mit dem Tony Award ausgezeichneten Musicals How to Succeed in Business Without Really Trying und erhielt dafür positive Kritiken. Über seinen Auftritt als Chorsänger in einer Highschool-Produktion desselben Musicals sagte Macchio: „Ich war als ‚Dancing Kid‘ bekannt, nicht dass ich so toll gewesen wäre. Aber ich tanzte seit meinem dritten Lebensjahr und nahm Unterricht an der June Claire School of Dance in Babylon, Long Island.“
Im Jahr 2005 spielte Macchio sich selbst in der HBO-Serie Entourage. 2007 trat er im Musikvideo zum Song „Sweep the Leg“ von No More Kings als Karikatur von sich selbst und Daniel aus The Karate Kid auf. 2008 trat er in einer VitaminWater-Werbung auf, in der der NASCAR-Fahrer Carl Edwards zu sehen war. Macchio wurde als Edwards‘ „spiritueller Berater“ dargestellt und trug seine Karate Kid-Kleidung. Seit Oktober 2008 ist er in mehreren Episoden der ABC Network-Fernsehserie Ugly Betty als Archie Rodriguez, einem Lokalpolitiker, zu sehen und hat eine halb-reguläre Rolle als Hildas Liebesinteresse in der Serie. Im November 2008 wurde Macchio auf Platz 80 von VH1’s 100 Greatest Teen Stars gewählt.
Im Juni 2010 trat Macchio in dem Online-Kurzfilm „Wax On, F*ck Off“ von Funny or Die auf, in dem seine Angehörigen eine Intervention inszenieren, um den ehemaligen Kinderstar von einem ausgeglichenen Familienvater in einen von Boulevard-Skandalen bedrängten Süchtigen zu verwandeln, alles, um seiner Karriere zu helfen. In dem Video reagiert Macchio darauf, dass er ein Plakat für die Neuverfilmung von Karate Kid 2010 sieht. Ein wiederkehrender Witz in dem Sketch ist, dass Macchio mit einem Jugendlichen verwechselt wird. Der Kurzfilm wurde von TV Guide’s Bruce Fretts gelobt, der das Video als „zum Totlachen“ und „komisches Gold“ bezeichnete. Am 20. September 2010 spielte Macchio den erwachsenen Carl Morelli in einer szenischen Lesung des Charles Messina-Stücks A Room of My Own, das von der Bleecker Street Theater Company präsentiert wurde. Im Februar 2011 wurde bekannt gegeben, dass er an der ABC-Show Dancing with the Stars teilnehmen würde. Er schied im Halbfinale aus und belegte in der Gesamtwertung den vierten Platz. Macchio spielte in den Musikvideos der kanadischen Band Danko Jones zu den Songs „Had Enough“ und „I Think Bad Thoughts“ mit, in denen auch Elijah Wood und Jena Malone zu sehen sind.
Im April 2012 wurde Macchio in dem Film Hitchcock besetzt, der auf dem Sachbuch Alfred Hitchcock and the Making of Psycho basiert und in dem Anthony Hopkins, Helen Mirren, Scarlett Johansson, Jessica Biel und Toni Collette mitspielen. Macchio porträtiert den Psycho-Drehbuchautor Joseph Stefano. Im Jahr 2013 war er in How I Met Your Mother zu sehen. Die Hauptfigur Barney Stinson behauptet, dass Macchios Figur, Daniel LaRusso, in Karate Kid nicht der echte Karate Kid ist, sondern Johnny Lawrence, Daniels Erzfeind im Film. In der Episode „The Bro Mitzvah“ der 8. Staffel wird Macchio zu Barneys Junggesellenabschied eingeladen, obwohl Barney von der Überraschung enttäuscht ist, da er den Schauspieler William Zabka, das „echte Karate Kid“, erwartet hat. Während der gesamten Episode bemerken die Charaktere die Ähnlichkeiten zwischen Barney und Macchio, zu Barneys Abscheu. Am Ende des Abends entpuppt sich der Clown, der für die Unterhaltung der Party engagiert wurde, als Zabka. Von Februar bis März 2016 spielte Macchio zusammen mit Mario Cantone die Hauptrolle in der Off-Broadway-Produktion A Room of My Own, nachdem er das Stück bereits 2010 und 2014 gelesen hatte.
Macchio spielt derzeit seine Rolle als Daniel LaRusso in Cobra Kai, einer Action-Comedy-Drama-Netflix-Serie, die in einem episodischen Erzählformat präsentiert wird und 2018 begann. Zusammen mit William Zabka ist er auch Co-Executive Producer der Serie. Die Serie spielt 34 Jahre nach den Ereignissen des All Valley Karate Tournament von 1984 und dreht sich um einen heruntergekommenen Johnny Lawrence (Zabka), der – um sein Leben wieder auf die Reihe zu bekommen und Wiedergutmachung für seine Niederlage im Turnier von 1984 zu erlangen – das Cobra Kai Dojo wiedereröffnet. Dies entfacht erneut seine Rivalität mit dem inzwischen erfolgreichen LaRusso, der ohne die Führung seines inzwischen verstorbenen Mentors Mr. Miyagi darum kämpft, sein Leben im Gleichgewicht zu halten.