Macchio comenzó a tomar clases de claqué a los 3 años y fue descubierto por un agente de talentos cuando tenía 16 años. Entonces fue contratado para interpretar a Jeremy Andretti en la serie de televisión Eight Is Enough. Tras el final de Eight is Enough, consiguió el papel de Johnny Cade en la película de 1983 The Outsiders. Este papel le llevó a interpretar a Daniel LaRusso en la película de 1984, The Karate Kid y dos de sus secuelas, The Karate Kid Part II y The Karate Kid Part III. Macchio apareció en la película de 1986 Crossroads, interpretando al estudiante de música Eugene Martone. También en 1986, Macchio protagonizó Cuba y su oso de peluche en Broadway, junto a Robert DeNiro. En 1992, protagonizó junto a Joe Pesci y Marisa Tomei la exitosa comedia Mi primo Vinny, en la que interpretaba a Billy Gambini, acusado injustamente de asesinato a su paso por un pequeño pueblo de Alabama. En 1996, Macchio interpretó el papel principal de J. Pierrepont Finch en la reposición de la gira estadounidense del musical How to Succeed in Business Without Really Trying (Cómo triunfar en los negocios sin intentarlo), ganador de un premio Tony en 1962, y recibió críticas positivas. Refiriéndose a su actuación como corista en una producción de la escuela secundaria del mismo musical, Macchio dijo: «Se me conocía como el ‘Niño Bailarín’, y no es que fuera tan bueno. Pero llevaba bailando desde los tres años, tomando clases en la June Claire School of Dance de Babylon, Long Island».
En 2005, Macchio se interpretó a sí mismo en la serie de HBO, Entourage. Apareció en el vídeo musical de 2007 de la canción «Sweep the Leg» de No More Kings como una caricatura de sí mismo y de Daniel de The Karate Kid. En 2008, apareció en un anuncio de VitaminWater en el que aparecía el piloto de NASCAR Carl Edwards. Macchio aparecía como «consejero espiritual» de Edwards y vestido con su ropa de Karate Kid. Desde octubre de 2008, ha aparecido en varios episodios de la serie de televisión Ugly Betty de la cadena ABC como Archie Rodríguez, un político local, con un papel semirregular como el interés amoroso de Hilda en la serie. En noviembre de 2008, Macchio ocupó el puesto número 80 entre las 100 mayores estrellas adolescentes de VH1.
En junio de 2010, Macchio apareció en el corto online de Funny or Die, «Wax On, F*ck Off», en el que sus seres queridos organizan una intervención para que la antigua estrella infantil deje de ser un hombre de familia bien adaptado y se convierta en un adicto asediado por el escándalo de la prensa sensacionalista, todo ello con el fin de ayudar a su carrera. Durante el vídeo, Macchio reacciona al ver un cartel del remake de Karate Kid de 2010. Una broma recurrente en el sketch es que Macchio se confunde con un adolescente. El corto fue alabado por Bruce Fretts, de TV Guide, que se refirió al vídeo como «sidesplitting» y «comic gold». El 20 de septiembre de 2010, Macchio interpretó al adulto Carl Morelli en una lectura escenificada de la obra de Charles Messina A Room of My Own presentada por la Bleecker Street Theater Company. En febrero de 2011 se anunció que competiría en el programa Dancing with the Stars de la ABC. Fue eliminado durante las semifinales, quedando en cuarto lugar en la competición general. Macchio apareció en los vídeos musicales del grupo canadiense Danko Jones para «Had Enough» y «I Think Bad Thoughts», en los que también aparecen Elijah Wood y Jena Malone.
En abril de 2012, Macchio formó parte del reparto de la película Hitchcock, basada en el libro de no ficción Alfred Hitchcock and the Making of Psycho, coprotagonizada por Anthony Hopkins, Helen Mirren, Scarlett Johansson, Jessica Biel y Toni Collette, y dirigida por Sacha Gervasi. Macchio interpreta al guionista de Psicosis, Joseph Stefano. En 2013, apareció en Cómo conocí a vuestra madre. El protagonista, Barney Stinson, afirma que el personaje de Macchio, Daniel LaRusso, en The Karate Kid no es el verdadero karate kid; en su lugar, es Johnny Lawrence, el némesis de Daniel en la película. En el episodio de la octava temporada «The Bro Mitzvah», Macchio es invitado a la despedida de soltero de Barney, aunque éste se siente decepcionado por la sorpresa, ya que esperaba al actor William Zabka, el «verdadero Karate Kid». Durante todo el episodio, los personajes observan las similitudes entre Barney y Macchio, para disgusto de Barney. Al final de la noche, el payaso contratado para el entretenimiento de la fiesta se revela como Zabka. De febrero a marzo de 2016, Macchio coprotagonizó junto a Mario Cantone la producción Off-Broadway A Room of My Own, después de haber leído la obra en 2010 y 2014.
Macchio retoma actualmente su papel de Daniel LaRusso en Cobra Kai, una serie de acción y comedia de Netflix presentada en formato de narración episódica, que comenzó en 2018. También es coproductor ejecutivo de la serie, junto con William Zabka. La serie está ambientada 34 años después de los acontecimientos del Torneo de Karate de All Valley de 1984 y gira en torno a un decaído Johnny Lawrence (Zabka) que -buscando reencauzar su vida y obtener redención por su derrota en el torneo de 1984- reabre el dojo Cobra Kai. Esto reaviva su rivalidad con un ahora exitoso LaRusso, que ha estado luchando por mantener el equilibrio en su vida sin la guía de su mentor ya fallecido, el Sr. Miyagi.