La alfa-sinucleína es una proteína de unión al ADN que modula la reparación del ADN con implicaciones para los trastornos de los cuerpos de Lewy

Humanos

El tejido de los sujetos humanos se obtuvo a través del Centro de la Enfermedad de Alzheimer de Oregón (ADC) y el Departamento de Patología de la OHSU y los sujetos afectados tenían diagnósticos clínicos y patológicos establecidos (demencia con cuerpos de Lewy). El uso de los tejidos fue aprobado por el IRB de la OHSU y se realizó de acuerdo con las directrices pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes y/o sus representantes legales.

Animales

Los animales fueron alojados por el Departamento de Medicina Comparada de la OHSU en un vivario con ciclo de luz-oscuridad y temperatura y humedad controladas y se mantuvieron con una dieta de agua y comida ad libitum. Todos los experimentos fueron aprobados por el IACUC de la OHSU, todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes, y se hizo todo lo posible para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento.

Generación de modelos de ratón

Líneas de ratones transgénicos

Utilizando el Núcleo de Modelos de Ratones Transgénicos de la OHSU, creamos un ratón que expresaba alfa-sinucleína humana fusionada con GFP mejorada (etiqueta C-terminal) que contenía una mutación puntual en la alanina 53 (GCA > ACA) causando un cambio de aminoácido de treonina (A53T Syn-GFP). La secuencia A53T-Syn-GFP se clonó en el vector MoPrp.Xho (regalo de David Borchelt)74 en el sitio XhoI. La expresión está bajo el control transcripcional del promotor de la proteína priónica del ratón. La secuencia de enlace de 30 pb entre A53T Syn y GFP es GGTACCGCGGCCCGGATCCATCGCCACC, que se traduce en GlyThrAlaGlyProGlySerIleAlaThr. Esta línea de ratones muestra la expresión de A53T Syn-GFP en >90% de las neuronas corticales y <10% de los astrocitos (A.J.S. y V.K.U., datos no publicados). Las líneas de ratones transgénicos 142E Syn-GFP32,33,39,75 y 142E Syn-GFP/ratón mSynKO se obtuvieron de los creadores de la línea, Edward Rockenstein y Eliezer Masliah. Los ratones transgénicos TdTomato-NLS de localización nuclear se obtuvieron de los Laboratorios Jackson (stock# 023035). Los animales knock-out de alfa-sinucleína y los ratones de control apropiados se obtuvieron de los Laboratorios Jackson (stock# 016123, 005304).

Generación del virus AAV8

Creamos construcciones virales de A53T Syn-GFP que contenían mutaciones puntuales en la alfa-sinucleína en la serina-129 que causaban un cambio de aminoácido de alanina (TCT > GCT) o de ácido aspártico (TCT > GAT) (construcciones regalo de Pamela McLean). Estas construcciones se clonaron en el vector viral AAV8 autocomplementario pTRS-KS/CBh-GFP (del National Gene Vector Biorepository, Indianápolis, IN), bajo el control transcripcional del promotor CBh (Chicken Beta Actin Short), utilizando los sitios de enzimas de restricción AgeI y ApaI. La secuencia de enlace de 30 pb entre la alfa-Syn & reforzada con GFP es GGTACCGCGGCCCGGATCCGACC. Los virus finales scAAV8-CBh-A53T-S129A-Syn-GFP y scAAV8-CBh-A53T-S129D-Syn-GFP fueron fabricados por el Gene Transfer Vector Core del Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Boston, MA.

Inyecciones virales intraventriculares de AAV8

Las inyecciones de AAV en neonatos P0 se realizaron siguiendo el protocolo de mano libre76. Se inyectaron 2 µL de virus sin diluir en cada ventrículo lateral a títulos ~1E12 copias genómicas por mililitro. La única desviación de este protocolo publicado es que no diluimos el virus en azul tripán.

Inducción de la patología de Lewy en ratones

Se inyectaron ratones machos de 2 a 3 meses de edad con PFF de la secuencia WT de ratón según nuestros protocolos publicados anteriormente25. Se inyectaron 2,5 μl (2 mg/ml) de PFF recién sonicados o 2,5 μl de PBS en la corteza sensomotora primaria del hemisferio derecho en animales anestesiados con isoflurano (1% a 2%) y se les devolvió a su jaula de origen. Se sacrificaron y se prepararon para la IHC como se describe a continuación después de un intervalo post-inyección de 3-6 meses (6-9 meses de edad).

Cerebro de ratón in vivo & análisis

La cirugía de la ventana craneal y la obtención de imágenes se realizó utilizando el mismo protocolo que hemos publicado previamente25,39 en animales anestesiados con isoflurano, utilizando un microscopio multifotónico Zeiss LSM 7MP equipado con detectores BiG de doble canal (GaAsP binario) y una fuente de láser de femtosegundo de zafiro Coherent Technologies Chameleon (sintonizada a 860 nm para la obtención de imágenes de Syn-GFP). Se utilizó el software de adquisición de imágenes Zeiss Zen 2011. Para los experimentos de daño nuclear inducido por láser (LID), se utilizó la función de blanqueo en Zen para iluminar pequeñas regiones de tamaño submicrónico dentro del núcleo con el láser Chameleon sintonizado a ~730 nm durante <1 ms). Se requiere un retardo de ~4 segundos para cambiar el láser a y desde la longitud de onda LID (~730 nm). En un subconjunto de experimentos, se generaron animales que expresaban Syn-GFP simultáneamente con TdTomato-NLS localizado en el núcleo. Estos demostraron que localizando el pulso LID a regiones >2 μm de la periferia de la célula se situaban siempre dentro del núcleo. Este criterio se utilizó para localizar el pulso LID dentro de los núcleos de las neuronas corticales que expresan Syn-GFP in vivo. Las imágenes LID se analizaron con ImageJ de forma similar a nuestros experimentos FRAP descritos anteriormente25,39. Se seleccionaron regiones de interés (ROIs) para obtener los valores medios de fluorescencia en LID y ROIs de control dentro del núcleo. La relación de la señal en cada punto de tiempo de la LID frente a las ROI de control se utilizó para calcular la relación de enriquecimiento. Para los experimentos FRAP después de LID, se utilizó un protocolo de fotoblanqueo y análisis similar al de nuestro trabajo publicado anteriormente25,39. Los datos se analizaron en Prism 6 (GraphPad) para obtener ajustes exponenciales simples para el curso del tiempo de recuperación y las fracciones inmóviles y móviles. Todos los animales utilizados tenían entre 5 y 9 meses de edad.

Cultivos de neuronas corticales de ratón y obtención de imágenes

Se utilizaron ratones C57/BL6 para generar cultivos neuronales primarios aislados de ratones embrionarios, basados en los métodos de Kaech y Banker77, y adaptados de Gray y colegas78. Brevemente, se cosecharon embriones a los 18 días de gestación de hembras anestesiadas. La corteza se diseccionó, se picó suavemente y se tripsinizó para generar suspensiones de neuronas dispersas. Las neuronas corticales recién aisladas se electroporaron con plásmidos que codificaban dos construcciones de alfa-sinucleína humana marcadas con una GFP mejorada (scAAV-huSyn_s129A:EGFP, scAAV-hySyn_s129D:EGFP). Se colocaron 330.000 neuronas corticales electroporadas de cada construcción en placas con cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina en medio MEM (GIBCO/Life Technologies), 5% de FBS (Atlanta Biologicals) y 0,6% de glucosa (Sigma-Aldrich). Después de 4 horas, se retiró el medio y se sustituyó por medio neurobasal suplementado con 1 × GlutaMAX (GIBCO/Life Technologies) y 1× GS21 (MTI-GlobalStem). Cada placa se alimentó cada semana con 0,5 ml de medio Neurobasal más GlutaMAX y GS21, y la primera alimentación (a los 5 días in vitro (DIV)) contenía AraC. Después de 7 DIV, los cubreobjetos de las neuronas cultivadas de cada construcción se visualizaron utilizando un sistema de células vivas con una cámara de imagen cerrada. Los experimentos de LID nuclear en cultivos celulares se llevaron a cabo en la misma plataforma de obtención de imágenes utilizando los mismos protocolos de obtención de imágenes y análisis que nuestros experimentos de LID nuclear in vivo descritos anteriormente.

Cultivos de hipocampo de ratón & Siembra de PFF

Los cultivos de hipocampo de ratón y la formación de patología de Lewy inducida por siembra de PFF se llevaron a cabo utilizando nuestras técnicas descritas anteriormente79,80. Brevemente, se prepararon cultivos neuronales primarios a partir de cerebros de ratones E16-E18 CD1 (Charles River). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania. Las neuronas disociadas del hipocampo se colocaron en cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina (Carolina Biological Supply) a una densidad de ~50.000 células/cm2. Los PFF de alfa-sinucleína humana recombinante con la mutación patógena S87N81 se diluyeron en PBS a 0,1 mg/mL, se sonicaron y se diluyeron en medios neuronales. Las neuronas se trataron con 5 ug/ml en el DIV 7 y se incubaron durante 12 días. Las células se fijaron en PFA al 4%/4% de sacarosa durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se permeabilizaron en Tx-100 al 0,3% y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en FBS al 3%/3% de BSA. Los anticuerpos primarios (antiα-Synuclein PhosphoSer129 clon 81 A, dilución 1:2000, Biolegend cat#825701; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) clon JBW301, dilución 1:500, Millipore cat#05-636) se diluyeron en el tampón de bloqueo y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas. A continuación se lavaron los cubreobjetos con PBS 3 veces y se incubaron con los anticuerpos secundarios marcados con Alexa-fluor adecuados. Los cubreobjetos lavados se montaron en portaobjetos utilizando Fluoromount-G con DAPI (Fisher Scientific).

Anticuerpos secundarios: Alexa 488, cabra anti ratón IgG2a, dilución 1:1000, Fisher Scientific; Alexa 594, cabra anti ratón IgG1, dilución 1:1000, Fisher Scientific.

Se utilizó un escáner de lámina PE para obtener imágenes de los cubreobjetos. Se utilizó el software HALO (Indica Labs) para contar los focos de γH2AX y los núcleos teñidos con DAPI situados a 1,5 mm del borde de cada cubreobjetos. El análisis estadístico de los datos se realizó con Graphpad Prism versión 4.

Análisis de inmunofluorescencia &

Células HAP1

Las líneas celulares Hap1 parental WT (artículo #C631 lote 29663) y Hap1 Human SNCA 103 bp deletion knockout (artículo #HZGHC003210c003 lote 2) se obtuvieron de Horizon Discovery y se cultivaron en medio IMDM (Gibco# 11995-065) + 10% de suero bovino fetal + Pen-Strep y se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 C con 5% de CO2. Las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos de PLL #1.5 en placas de 35 mm un día antes de la fijación y se cultivaron hasta un ~80% de confluencia. Las células se fijaron en PFA al 4% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT), se lavaron 1 vez en PBS y se almacenaron a 4 C en PBS hasta el procedimiento de tinción. Las células fijadas se permeabilizaron con 1 mL de PBS + 0,25% de Triton-X 100 agitando suavemente a RT durante 20 minutos. Se eliminó la solución y se bloquearon las células durante 20 minutos en 1 mL de tampón de bloqueo (0,1% Triton-X 100 10% de suero normal de cabra en PBS). Los anticuerpos primarios se diluyeron en tampón de incubación (dilución 1:5 de tampón de bloqueo en PBS) y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave. Al día siguiente, las células se lavaron 3 veces en PBS durante 15 minutos. Los anticuerpos secundarios complementarios marcados con fluorescencia se diluyeron 1:1000 en tampón de incubación, se añadieron a las células y se incubaron a temperatura ambiente, en la oscuridad, con agitación suave. Al día siguiente, las células se lavaron 3 veces en PBS durante 20 minutos. La tinción nuclear se realizó justo antes del último lavado en PBS con 2,5ug/mL de DAPI (Sigma D9542) en PBS durante 20 minutos. Antes del montaje, las células se lavaron brevemente en H2O desionizada. Los cubreobjetos se montaron con 13 µl de CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution y se sellaron con Biotium CoverGrip Coverslip Sealant. Los portaobjetos se visualizaron en un microscopio confocal de barrido láser Zeiss Elyra PS.1 710 con el software Zen. Se adquirieron pilas Z de pasos de 0,5 µm con un zoom de 63×1, teniendo cuidado de no saturar nunca la señal del anticuerpo dentro del núcleo.

Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-Syn1, dilución 1:500, monoclonal de ratón, BD Biosciences, cat. 610786; anti-Polímero (ADP-Ribosa) clon 10 H, dilución 1:500, policlonal de pollo, Tulip BioLabs, cat. 1023; anti-fosfo-histona H2A.X, dilución 1:500, monoclonal de conejo, Cell Signaling, cat. 9718; anti-fosfoS129-Syn EP1536Y, dilución 1:500, monoclonal de conejo, Abcam, ab51253; anti-fosfoS129-Syn 81 A, monoclonal de ratón dilución 1:667, Covance, cat. 825701; anti-Syn 4B12, dilución 1:500, monoclonal de ratón, Biolegend, cat. 807804; y anti-Syn EPR20535, dilución 1:100, monoclonal de conejo, Abcam, ab212184. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: Alexa Fluor 647 anti-conejo de cabra, ThermoFisher cat.A-21245; Alexa Fluor 555 anti-ratón de cabra, Abcam ab150114; Alexa Fluor 488 anti-pollo de burro, Jackson ImmunoResearch cat.703-545-155.

Tratamiento con bleomicina ICC: El polvo de sulfato de bleomicina (Selleckchem, cat. S1214) se diluyó en H2O para hacer una solución madre de 10 mg/mL, se alicuotó y se almacenó a -80C. Un día antes del tratamiento, las células Hap1 WT y Hap1 SNCA KO se sembraron en cubreobjetos recubiertos de PLL #1.5 en placas de 35 mm para que fueran confluentes en un ~80% al día siguiente. El día del tratamiento, se retiró el medio normal y se añadieron 2 mL de medio caliente fresco con 10ug/mL de bleomicina a cada placa. A las células simuladas se les añadió medio caliente fresco, sin Bleomicina, a cada placa. Las células se colocaron en una incubadora humidificada durante 1 hora a 37 C con 5% de CO2. Después del tratamiento, se eliminó el medio y las células se fijaron en PFA al 4% en PBS durante 10 minutos a RT, se lavaron 1 vez en PBS y se almacenaron a 4 C en PBS hasta el procedimiento de tinción.

Tratamiento con Bleomicina Western Blot: Un día antes del tratamiento las células Hap1 WT y Hap1 SNCA KO se sembraron en placas de 2 × 10 cm por condición para ser ~80% confluentes al día siguiente. El tratamiento con bleomicina se realizó de la misma manera que para la CCI. Tras el tratamiento, se eliminó el medio y las células se lavaron 1 vez con PBS caliente. Las células se cosecharon por tripsinización y se recogieron en tubos cónicos de 15 mL y se pelletearon durante 5 minutos a 200rcf. Se aspiró el líquido, se resuspendieron los pellets en 2 mL de PBS y se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 2 × 2 mL. Las proteínas se extrajeron en fracciones citosólicas y nucleares utilizando el kit de extracción NE-PER (Thermo-Fisher, cat. 78833) según las recomendaciones del fabricante, añadiendo una breve sonificación (10 segundos, 10 kHz) después del primer paso de resuspensión nuclear. Las preparaciones de proteínas se almacenaron a -80C hasta el análisis de Western blot.

Para la obtención de imágenes confocales, se adquirieron imágenes en un microscopio confocal Zeiss Elyra PS.1 con un objetivo de aceite Plan-Apochromat 63x/1.40. Todos los análisis de colocalización se realizaron utilizando el software ImageJ (NIH) creando ROIs para cada núcleo a partir de una única imagen situada en el centro del núcleo en la dirección z. Se utilizó el plugin CoLoc 2 para medir el coeficiente de Pearson entre las señales y el valor de fondo esperado tras la traslación aleatoria de un canal frente al otro.

Cerebro de ratón

Los cerebros de los ratones machos (de 3 a 6 meses de edad) se diseccionaron inmediatamente post mortem, se colocaron en 6 mL de PFA fresco al 4% en PBS y se fijaron con un Pelco Biowave Pro durante 90 minutos a 150 W en un baño de agua circulante. Los cerebros se trasladaron a 4 °C para seguir fijándolos durante la noche. Al día siguiente se sustituyó el PFA por azida sódica al 0,05% y se almacenó a 4 °C hasta su posterior procesamiento.

Después de la fijación, los cerebros se cortaron en secciones flotantes coronales o sagitales de 50 µm utilizando un Vibratome Leica VT1000S. Para ciertos anticuerpos, se requirió la recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) antes del bloqueo. El corte de cerebro se añadió a un tubo que contenía tampón HIER (1 mM de EDTA, 10 mM de Tris Base, 0,05% de Tween, pH = 8.5), se vaporizaron durante 20 minutos y se enfriaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. El tejido se bloqueó durante 1 hora en tampón de bloqueo (0,1% Triton-X, 10% de suero de cabra, en PBS). El anticuerpo primario se diluyó en tampón de incubación (dilución 1:5 del tampón de bloqueo) a una concentración optimizada para cada anticuerpo y se incubó durante la noche, en la oscuridad, mientras se agitaba a temperatura ambiente. El tejido se lavó durante 30 minutos con PBS 5 veces. El anticuerpo secundario complementario se diluyó en tampón de incubación y se incubó de forma similar durante toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, el tejido se lavó con 5 intercambios de PBS. La tinción con DAPI se realizó justo antes del último lavado. El tejido se montó en un portaobjetos en solución antifúngica CitiFluor CFMR2. Se selló un cubreobjetos nº 1,5 sobre el tejido con Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anticuerpo anti-α-Sinucleína fosfo (Ser129) clon 81 A, monoclonal de ratón, dilución 1:667, Biolegend cat#825701; anticuerpo anti-alfa-Sinucleína (fosfo S129) , monoclonal de conejo, dilución 1:500, Abcam cat#ab51253; antiasín (Syn1/mSyn), monoclonal de ratón, dilución 1:500 dilución, BD Biosciences cat#610786; Anti-pan-ADP-ribose binding reagent, conejo, dilución 1:1000, Millipore cat#MABE1016; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer, clon 10 H (PADPR), pollo, dilución 1:100, Tulip BioLabs cat#1023; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) clon JBW301, ratón, dilución 1:500, Millipore cat#05-636; Anticuerpo anti-fosfo-Histona H2A.X (Ser139) clon 20E3, monoclonal de conejo, dilución 1:500, Cell Signaling cat#9718 Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: Alexa 647, anti-conejo de cabra, dilución 1:1000, Invitrogen cat#MPA21245; Alexa 647, anti-ratón de cabra, dilución 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, anti-conejo de cabra, dilución 11000 dilución, Abcam cat#ab150078; Alexa 555, cabra anti-ratón, 1:1000 dilución, Abcam cat#ab150114; Alexa 488, cabra anti-pollo 1:1000 dilución, Abcam cat# ab150169.

Para las imágenes confocales, se adquirieron imágenes en un microscopio confocal Zeiss Elyra PS.1 con un objetivo de aceite Plan-Apochromat 63x/1.40. Se utilizaron potencias de láser de 1-5% para adquirir pilas z a través de 2-4 regiones de corteza por sección de tejido. Se utilizó el software de imágenes Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) para analizar los datos de IHC. Para segmentar el núcleo del citoplasma, se creó una superficie utilizando el canal DAPI. Sólo se analizaron los núcleos neuronales completos. Se exportó la información estadística (intensidad media, intensidad sumada, número total de superficies) para cada canal y se analizó posteriormente en Prism 6 (GraphPad). Para el análisis de los focos dentro de los núcleos, se enmascaró la señal nuclear del canal elegido utilizando una superficie nuclear creada a partir del canal DAPI. A partir de la señal nuclear del canal enmascarado deseado, se realizaron superficies para cuantificar los focos nucleares.

Cerebro humano

Secciones de la amígdala de casos humanos de autopsia de Demencia con Cuerpos de Lewy se recuperaron inmediatamente en la autopsia (intervalo post-mortem de 12-48 horas), se colocaron en 6 mL de PFA fresco al 4% en PBS y se fijaron con un Pelco Biowave Pro durante 90 minutos a 150 W en un baño de agua circulante. Las secciones se trasladaron a 4 °C para seguir fijándolas durante la noche. Al día siguiente, el PFA se sustituyó por azida sódica al 0,05% y se almacenó a 4 °C hasta su posterior procesamiento.

Después de la fijación, las secciones de amígdala se cortaron en secciones flotantes de 50 µm utilizando un Vibratome Leica VT1000S. El tejido se bloqueó durante 1 hora en tampón de bloqueo (0,1% Triton-X, 10% de suero de cabra, en PBS). El anticuerpo primario se diluyó en tampón de incubación (dilución 1:5 del tampón de bloqueo) a una concentración optimizada para cada anticuerpo (véase más abajo) y se incubó durante toda la noche, en la oscuridad, mientras se agitaba a temperatura ambiente. El tejido se lavó durante 60 minutos con PBS 5 veces. El anticuerpo secundario complementario se diluyó en el tampón de incubación y se incubó de forma similar durante toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, el tejido se lavó con 5 intercambios de PBS. La tinción con DAPI se realizó justo antes del último lavado. El tejido se montó en un portaobjetos en solución antifúngica CitiFluor CFMR2. Se selló un cubreobjetos nº 1,5 sobre el tejido con Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anticuerpo antiα-Synuclein Phospho (Ser129) clon 81 A, monoclonal de ratón, dilución 1:667, Biolegend cat#825701; anticuerpo anti-histona H2A.X (Ser139) clon 20E3, monoclonal de conejo, dilución 1:500, Cell Signaling cat#9718. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron Alexa 647, antiratón de cabra, dilución 1:1000, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 488, anti-conejo de cabra, dilución 1:1000, Abcam cat#ab150077.

Las imágenes se capturaron en un microscopio Zeiss LSM 880 con Airyscan. Para determinar las señales específicas de los anticuerpos a partir del aumento de la tinción de fondo autofluorescente dentro de las muestras de tejido humano, se utilizó un protocolo de desmezcla lineal. Se utilizó el modo lambda para configurar los parámetros del objetivo, los láseres y los dicroicos según fuera necesario para obtener imágenes de la muestra multicolor. Utilizando los mismos parámetros, se crearon espectros de referencia individuales a partir de muestras teñidas de un solo color. Además, se utilizó una muestra no teñida para determinar los espectros de referencia de fondo. Al crear los espectros de referencia se minimizaron todos los residuos. A continuación, se crearon imágenes de la muestra multicolor, especificando el fondo relevante y los espectros de un solo color, y se desmezclaron utilizando el software Zeiss Zen.

Se utilizó el software de creación de imágenes Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) para analizar los datos de IHC. Para segmentar el núcleo del citoplasma, se creó una superficie utilizando el canal DAPI. Sólo se analizaron los núcleos neuronales completos. Se exportó la información estadística (intensidad media, intensidad sumada, número total de superficies) para cada canal y se analizó posteriormente en Prism 6 (GraphPad). Para el análisis de los focos dentro de los núcleos, se enmascaró la señal nuclear del canal elegido utilizando una superficie nuclear creada a partir del canal DAPI. A partir de la señal nuclear del canal enmascarado deseado, se realizaron superficies para cuantificar los focos nucleares.

Asayo cometa de células HAP1

Los ensayos cometa neutros de células HAP1 se realizaron según las recomendaciones de Trevigen (kit de ensayo cometa de Trevigen, cat#4250-050-K). Las suspensiones celulares (2 × 104 células/ml) en IMDM libre de suero (Sigma) mezcladas en una proporción de 1:2 con LMAgarosa Comet (Trevigen) se pipetearon en CometSlidesTM (Trevigen) y se colocaron a 4 °C durante 10-15 minutos para su moldeado. Los portaobjetos se incubaron durante toda la noche en solución de lisis (Trevigen) a 4 °C en la oscuridad y luego en tampón de electroforesis neutro (300 mM de acetato de sodio, 100 mM de Tris-HCl, pH 9) durante 1 hora a 4 °C en la oscuridad. Los portaobjetos se electroforizaron en tampón fresco durante 40 minutos a 20 V (1 V/cm) a 4 °C. Tras la electroforesis, los portaobjetos se incubaron primero en el tampón de precipitación de ADN (acetato de amonio 1 M, 86,6% de EtOH) y luego en EtOH al 70% a temperatura ambiente y en la oscuridad, durante 30 minutos cada uno y se secaron a 37 °C. Los portaobjetos se tiñeron con 1X SYBRTMgreen (Invirogen) en 1X PBS (Gibco) a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad, se sumergieron en dH2O 10 veces para lavar el exceso de tinte y se secaron a 37 °C. Los cometas se visualizaron en un Zeiss Apotome utilizando un objetivo de 10X y se puntuaron utilizando CometScoreTM.

Ensayo de cometas por tratamiento con bleomicina: Un día antes del tratamiento las células Hap1 WT y Hap1 SNCA KO se sembraron en placas de 2 × 35 mm por condición para ser ~80% confluentes al día siguiente. Los protocolos de tratamiento con bleomicina y Sham se hicieron igual que para la CCI. Tras el tratamiento, se eliminó el medio y las células se lavaron 1 vez con PBS caliente. Si seguía un periodo de recuperación, se añadía medio caliente fresco y las células se volvían a colocar en la incubadora. Las células se cosecharon por tripsinización con Tripsina-EDTA al 0,05% (Gibco cat. 15400-54). Las células tripsinizadas de las placas de 2 × 35 mm se recogieron en tubos cónicos de 15 mL y se pelletearon durante 5 min 200rcf. Se aspiró el líquido, los pellets se resuspendieron en 250uL de medio fresco sin FBS o Penn-Strep, se transfirieron a un tubo de microcentrífuga de 2 mL y se almacenaron en hielo hasta su uso en el ensayo cometa como se ha descrito anteriormente.

Ensayo cometa en tejido cerebral de ratón

El tejido cerebral recién extraído de ratones macho (de 1, 3, 6-9 meses de edad) se picó finamente con una cuchilla de afeitar y se suspendió en PBS frío (sin Ca2+ y Mg2+) y se homogeneizó durante 30 segundos utilizando un homogeneizador manual. El tejido se microcentrifugó durante un minuto y el sobrenadante se diluyó 1:10 en PBS. Se contaron las células con un hemocitómetro y se diluyeron a 1 × 105/ml. Las células diluidas se combinaron con Agarosa de baja fusión (LM) en una proporción de 1:2 (v/v) y se extendieron sobre el pozo del portaobjetos de vidrio del cometa (Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K). Los portaobjetos se secaron en la oscuridad a 4 °C durante 15 minutos y se colocaron en la solución de lisis del kit a 4 °C durante la noche. El exceso de tampón se drenó de los portaobjetos antes de sumergirlos en 50 mL de TBE, pH 7,4, durante 30 minutos a 4 °C. Los portaobjetos se sometieron a electroforesis en TBE, pH 7,4, a 20 V durante 40 minutos a 4 °C. El exceso de TBE se drenó y los portaobjetos se colocaron en dH2O dos veces durante 5 minutos. A continuación, los portaobjetos se colocaron en EtOH al 70% durante 5 minutos y se secaron a 37 °C durante 15 minutos. Se pipetearon 100 µl de SYBR-Green 1X en cada círculo de agarosa seca y las muestras se tiñeron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se eliminó el exceso de solución SYBR-Green y los portaobjetos se enjuagaron en dH2O varias veces. Los portaobjetos se dejaron secar completamente a 37 °C y se almacenaron a 4 °C. Los cometas se visualizaron en un microscopio Zeiss ApoTome con un objetivo de 10X y se puntuaron utilizando el software CometScore™ (TriTek).

Asayo de desplazamiento de movilidad electroforética

Preparación del ADN

Se extrajeron fragmentos de 300 pb a partir de una escalera de 100 pb (NEB) y se separaron en un gel de agarosa al 1% a 175 V durante 2 horas a RT utilizando el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). El ADN se limpió utilizando el kit de limpieza y concentración de ADN (Zymo Research), y se eluyó en 1X TE. La concentración final y la pureza del ADN se determinaron mediante Nanodrop.

Asunto de desplazamiento de movilidad electroforética

Los fragmentos de ADN (20 ng) se mezclaron con hu_ser129_phospho-syn recombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg y 16 µg; Proteos, Inc.), hu_α-sinucleína recombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg y 16 µg; Proteos, Inc.) o glutatión S-transferasa recombinante (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg y 16 µg; GenScript) en una reacción de 20 μL que contenía 94 mM de Tris-Cl, pH 8,0, 25 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, y 5% de ficoll en hielo durante 20 min, y luego a temperatura ambiente durante 30 min. Tras añadir 2 µL de tampón de carga naranja 10X (Licor), se cargaron 8 μL de la reacción total en un gel TBE de poliacrilamida al 10% o al 6% (Novex) y se ejecutó a 100 V durante 2 horas a RT. Los geles se tiñeron durante 30 minutos con 10X SYBRTM Safe DNA Stain (Invitrogen) en 1X TBE. Las imágenes se adquirieron utilizando el sistema de imágenes Fluorchem M y se cuantificaron utilizando la herramienta ImageJ Gel Analyzing.

Western blot

Los geles de poliacrilamida TBE al 10% se transfirieron a una membrana de nylon Biodyne™ B (Thermofisher Scientific) a 30 V durante 1 hora y 16 min en hielo en TBE 0,5X utilizando el sistema de blotting Novex XCell II (Invitrogen). Las membranas se bloquearon durante la noche en tampón de bloqueo Odyssey PBS (Li-Cor) y se tiñeron durante 1 hora a RT con Syn1 (1:1.000; Biolegend) y durante la noche a 4 °C con IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG (1:10.000; Li-Cor). Las imágenes se adquirieron utilizando el sistema de imágenes Li-Cor Odyssey CLx.

Western Blot para preparaciones de proteínas nucleares de Hap1: Las concentraciones de las preparaciones de proteínas citoplasmáticas y nucleares de Hap1 NE-PER se cuantificaron utilizando el kit Pierce BCA Protein Assay (Pierce, cat. 23225) y se leyeron en un fotómetro de microplacas Multiskan FC (Fisher, cat. 51119000) con una lectura de 550 nm. Se diluyeron 5 µg & 10 µg de proteína nuclear en tampón de muestra SDS (Novex, cat. LC2676) + BME (Gibco, cat. 21985-023) y se cargaron en un gel de Tris-Glicina al 10-20% (Novex, cat. XP10202BOX). Se cargaron 3 µl de una escalera de proteínas teñida (NEB, cat. P7719) como referencia. El gel se corrió utilizando el sistema de blotting Novex Xcell en tampón SDS (Novex, cat. LC2675) durante 70 minutos a 120 V. El gel se desmontó y se preparó para su transferencia a una membrana Immobilon-FL PVDF (Millipore, cat. IPF00010). El gel se transfirió en tampón de transferencia Tris-Glicina (Novex, cat. LC3675) en hielo durante 2 horas a 25 V. Tras la transferencia, se retiró la membrana y se fijó inmediatamente en PFA al 4% + Glutaraldehído al 0,01% durante 10 minutos con agitación suave a temperatura ambiente. La membrana se lavó 1 vez en milliQ H2O y se tiñó con el kit de tinción de proteínas totales REVERT (LI-COR, cat. 926-11010) según el protocolo del fabricante. La proteína total teñida se adquirió utilizando el LI-COR Odyssey CLx Imager. Después de la inversión de la tinción REVERT, la membrana se lavó 1 vez en milliQ H2O y se bloqueó en tampón de bloqueo Odyssey (LI-COR, cat. 927-40000) durante una noche a 4 C con agitación suave. Los anticuerpos primarios se diluyeron 1:1000 en tampón de bloqueo y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. La membrana se lavó 3 veces en Tween20 al 0,1% en PBS durante 10 minutos. Los anticuerpos secundarios (LI-COR IR680LT anti-conejo cat. 926-68023; IR800CW burro anti-ratón cat. 926-32212) se diluyeron 1:10000 en tampón de bloqueo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. La membrana se lavó 3 veces en Tween20 al 0,1% en PBS durante 10 minutos y 1 vez en PBS durante 10 minutos, a temperatura ambiente. Las imágenes se adquirieron utilizando el LI-COR Odyssey CLx Imager. El análisis se realizó en la FIJI utilizando el analizador de gel. La señal del anticuerpo se normalizó con respecto a la proteína total de REVERT.

Asunto de unión final de ADN mediado por ligasa T4

Cada reacción de unión final contiene 150 ng de un producto de PCR de ADN de 1,2 kb digerido en los extremos 5′ y 3′ con la enzima de restricción de extremos cohesivos XhoI (NEB RO146S). Las reacciones se llevan a cabo en un volumen de reacción de 20 µL que contiene 150 ng de ADN digerido, 2,8 µL de tampón de proteínas (10 mM Tris, 50 mM NaCl pH = 7,6), 5,3 µL de glicerol al 20% en PBS + Mg + Ca, 2 µL de tampón de ligasa T4, 200 ng o 40,5 ng de proteína, 25U de ligasa T4 (NEB M0202) y H2O estéril hasta el volumen. Todos los componentes, excepto la T4 ligasa, se combinaron y se incubaron en hielo durante 15 minutos. Se añadieron 25U de T4 ligasa a la reacción y se incubaron a temperatura ambiente durante 90 minutos. Tras la incubación, la reacción se limpió inmediatamente con una columna Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research) y se eluyó en 15 µl de H2O estéril. Se añadió SybrGreen y tampón de carga al ADN y las muestras se electroforizaron en un gel TAE de agarosa al 1% durante 1 hora a 135 V y se obtuvieron imágenes en un generador de imágenes de fluorescencia y quimioluminiscencia Syngene G:BOX. Se utilizó ImageJ para analizar la imagen del gel y los datos se graficaron utilizando Prism 6 (GraphPad).

Diseño experimental & análisis estadístico

Todos los valores cuantificados se reportan como la media ± SEM. El tipo y número de muestra relevante (N), y las pruebas estadísticas utilizadas para evaluar la significación de cada experimento se presentan con cada conjunto de datos. Los tamaños de muestra utilizados en cada experimento se basaron en las estimaciones de los tamaños de los efectos esperados (~10-50%) y en las desviaciones estándar de los datos preliminares y se potenciaron para detectar diferencias con un nivel de significación de 0,05 (α) y una potencia de 0,9 (1-β).