Amostras aquosas, células lisadas, ou tecido homogeneizado são misturadas com volumes iguais de uma mistura de fenol:clorofórmio. Esta mistura é então centrifugada. Como a mistura de fenol:clorofórmio é imiscível com água, a centrífuga irá causar a formação de duas fases distintas: uma fase aquosa superior, e uma fase orgânica inferior. A fase aquosa sobe para cima porque é menos densa que a fase orgânica que contém o fenol:clorofórmio. Esta diferença na densidade é porque o fenol, que tem apenas uma densidade ligeiramente superior à da água, deve ser misturado com o clorofórmio para formar uma mistura com uma densidade muito superior à da água.
Os lípidos hidrofóbicos dividem-se na fase orgânica inferior, e as proteínas permanecem na interfase entre as duas fases, enquanto os ácidos nucleicos (assim como outros contaminantes como sais, açúcares, etc.) permanecem na fase aquosa superior. A fase aquosa superior pode então ser pipetada. Deve-se ter cuidado para evitar a pipetagem de qualquer fase ou material orgânico na interface. Este procedimento é frequentemente realizado várias vezes para aumentar a pureza do ADN. Este procedimento produz ADN duplo de grande dimensão que pode ser usado em PCR ou RFLP.
Se a mistura for ácida, o ADN precipita-se na fase orgânica enquanto o RNA permanece na fase aquosa. Isto porque o DNA é mais facilmente neutralizado do que o RNA.
Existem algumas desvantagens desta técnica no uso forense. É demorada e utiliza reagentes perigosos. Além disso, por ser um processo de duas etapas que envolve a transferência de reagentes entre tubos, tem um risco maior de contaminação.