Avec l’avènement des souris génétiquement modifiées, il est désormais possible d’étudier chacun des trois composants du système MCC (battement ciliaire, production de mucus et hydratation de la surface des voies respiratoires) de manière isolée afin de déterminer comment ils interagissent pour assurer une MCC normale. Cependant, il est essentiel pour notre capacité à comprendre l’interrelation entre les composants du système MCC de pouvoir mesurer avec précision le taux de MCC chez la souris.
Bien qu’un certain nombre d’études aient mesuré le MCC chez la souris par diverses techniques, beaucoup d’entre elles présentent des lacunes techniques et un large éventail de taux de MCC est rapporté. Les taux de MCC trachéal (ou transport de particules) pour la « trachée de souris normale » rapportés dans la littérature diffèrent largement de 15 mm/min6 à 0,031 mm/min21. Une grande partie de la variabilité rapportée est probablement due aux différences entre les techniques utilisées pour mesurer le MCC, en plus d’autres facteurs (par exemple, la souche des souris, l’âge, etc.)8,14.
L’une des premières études rapportées a mesuré le MCC dans les trachées intactes de souris vivantes en introduisant des billes fluorescentes de ~3 μm dans la cavité nasale (volume de 15 µl), puis en mesurant le transport des billes aspirées par fluorescence trans-trachéale des particules8. Cette étude a révélé que de nombreuses souris ne présentaient aucun MCC et que de nombreuses billes présentaient un transport de type » stop/go « . Cette étude a également révélé que la souche des souris étudiées influençait de manière significative le taux de MCC. D’autres ont mesuré la clairance inférieure des voies respiratoires chez la souris vivante par scintigraphie après avoir instillé un grand volume (~50 μl) d’un émetteur gamma dans les voies respiratoires9. Ces deux études souffrent de l’instillation d’un volume relativement important de liquide sur les voies respiratoires et de la perturbation du volume de liquide de surface des voies respiratoires, dont il a été démontré qu’elle modifie le MCC8,13,22.
Il existe un certain nombre d’études dans la littérature dans lesquelles le MCC a été mesuré dans la trachée murine ouverte21,23,24. Bien que cette technique de CMC puisse être techniquement la plus facile, elle est probablement la plus problématique en raison de la difficulté à maintenir la température et l’hydratation normale des voies respiratoires, deux éléments qui sont d’une importance critique pour un CMC normal. Les taux de MCC rapportés pour ces préparations vont de 0,031 mm/min à 4,5 mm/min21,24. Le MCC chez la souris a également été mesuré dans une préparation de poumon excisé25, mais cette méthode a également utilisé de grands volumes de liquide, similaires aux préparations trachéales ouvertes avec une inondation marquée du poumon excisé, perturbant probablement le MCC normal.
Une technique de microdialyse in vivo a été utilisée avec succès pour identifier les perturbations du MCC dues à une manipulation génétique dans les voies respiratoires inférieures chez la souris11. Cette technique consiste à placer une très petite sonde de microdialyse sur la surface des voies respiratoires13 et un petit volume de traceur (250 nl) est ajouté de manière distale à l’épithélium des voies respiratoires. Le temps nécessaire au colorant pour atteindre la sonde est enregistré et la CMC calculée. Bien que cette technique minimise la quantité de liquide exogène ajoutée à la surface des voies aériennes, elle prend un peu de temps, nécessite de placer une petite ouverture dans la trachée et le placement de la sonde peut perturber le MCC.
Une autre technique qui a été utilisée avec beaucoup de succès pour étudier le MCC sur un certain nombre de souris génétiquement modifiées consiste à placer une quantité connue de billes fluorescentes dans un très petit échantillon de liquide (~150 nl) directement dans la trachée inférieure/bronches principales14,26,27,28. Après 15 minutes, les billes restant dans la trachée/les bronches principales sont comptées et le pourcentage de clairance est calculé. Bien que seule une très petite incision soit pratiquée dans la trachée supérieure pour introduire les billes, on ne peut pas affirmer avec certitude que le milieu liquide de surface des voies respiratoires n’est pas perturbé par le placement transitoire de la canule d’introduction des billes ou par le petit volume de liquide utilisé pour introduire les billes. De plus, bien que ces études semblent donner de bonnes données sur la clairance et fournissent des différences claires dans le MCC entre WT et les souris avec des mutations censées perturber le MCC14,26,27,28, les taux réels de clairance ne sont pas obtenus avec cette technique.
Une technique plus optimale pour mesurer le MCC impliquerait l’introduction d’un traceur chez une souris vivante sans ouvrir la trachée et le suivi du traceur à travers la trachée fermée. Cela a été rapporté par Donnelley et al.16, mais leur technique a nécessité l’intubation de la souris pour délivrer une poudre sèche pour le suivi et un équipement coûteux pour l’imagerie (un synchrotron) qui n’est disponible que dans quelques endroits dans le monde. Avec cette configuration, les taux de base du MCC étaient très faibles (0,27 mm/min) et la majorité des particules étaient stationnaires, ce qui reflète probablement la dessiccation des voies respiratoires, les souris intubées étant ventilées avec un FlexVent et respirant probablement de l’air sec. Lorsque les souris ont été aérosolisées pendant 2,5 min avec du NaCl isotonique après l’insufflation des particules, le taux de MCC a augmenté de manière significative et était de l’ordre de 2 à 3 mm/min, ce qui n’est pas différent de ce que nous avons mesuré dans la présente enquête (le MCC moyen avec le NaCl isotonique dans notre étude était de 3,3 mm/min).
Une étude a récemment été publiée dans laquelle l’imagerie in vivo sans intubation utilisant la microscopie à deux photons a été utilisée pour mesurer le MCC chez les souris29. En effet, les auteurs ont constaté que l’intubation perturbait considérablement la mesure précise du MCC et ont donc conclu que cette procédure devait être évitée dans les études murines sur le MCC. Ils ont donc introduit le traceur dans les voies respiratoires par aspiration oropharyngée en utilisant un volume de liquide relativement important (20 µl). De manière similaire à ce que nous avons observé dans notre étude, Veres et al. rapportent que les billes fluorescentes (0,5 um de diamètre) ont formé des agrégats, qu’ils ont suivis pour déterminer le taux global de MCC (~1,1 mm/min). Bien que la méthode utilisée par Veres et al. pour préparer la trachée à la visualisation était très similaire à celle utilisée dans nos études, l’imagerie avec la microscopie à deux photons nécessitait une installation plus élaborée et plus coûteuse par rapport à notre méthode, qui ne nécessite qu’un microscope de dissection interfacé avec une caméra CCD et un éclairage fluorescent.
Notre méthode de mesure du MCC délivre le traceur par inhalation d’aérosol nasal, ajoutant un très faible volume de liquide dans les voies respiratoires (0,095 µl/5-min d’aérosol), et la trachée reste fermée et intacte pour les mesures du MCC. Fait important, nous avons constaté que le taux de MCC était presque identique chez les souris vivantes ou peu après leur euthanasie. Ceci était plutôt surprenant car nous avions supposé que l’euthanasie pouvait provoquer une stimulation adrénergique (ou la libération d’autres neurotransmetteurs) susceptible de stimuler le MCC30. L’absence d’excursion respiratoire chez les souris euthanasiées facilite l’imagerie des particules, et donc les mesures du MCC sur une souris non vivante peuvent être techniquement plus faciles que d’effectuer de telles mesures sur un animal qui respire.
Nous n’avons trouvé aucun effet significatif de la durée de l’anesthésie à l’isoflurane (5 ou 25 min) sur le taux de MCC. La plupart de nos études ont été menées avec des souris anesthésiées à l’isoflurane, mais comme l’accès à un vaporisateur dédié n’est pas toujours possible et que l’administration simultanée d’isoflurane et d’un aérosol peut être difficile, nous avons mené une série d’études en utilisant l’anesthésique injectable, Avertin, qui est largement disponible et non réglementé par la FDA, comme le sont de nombreux anesthésiques injectables. Le taux de MCC n’était pas différent entre les deux anesthésiques. Bien que le nombre de radeaux de billes que nous avons compté chez les souris anesthésiées à l’Averétine était légèrement inférieur à celui du groupe isoflurane, cette différence n’était pas significative. Il est à noter que beaucoup plus de billes adhéraient aux parois de la trachée dans le groupe anesthésié à l’isoflurane et que les radeaux de billes des souris Averetin étaient beaucoup plus petits que ceux des souris isoflurane. Nous émettons l’hypothèse que ces différences pourraient être dues à des différences dans la quantité de billes déposées dans les poumons des deux groupes de souris, ou dans leur mode de dépôt, d’autant plus que la fréquence respiratoire et les volumes courants différaient entre les souris recevant les deux anesthésiques.
La durée de l’aérosolisation a eu un effet significatif sur le taux de MCC, et nous avons déterminé que cela était dû à la masse de billes délivrée, les périodes d’aérosolisation plus courtes (5 min) donnant des taux de MCC plus importants que les aérosolisations plus longues (15 min). Il est peu probable qu’une différence dans l’administration du liquide explique les résultats, car les souris aérosolisées avec des billes 1/3x pendant 15 minutes ont reçu ~3 fois plus de liquide que les souris ayant reçu des billes 1x pendant 5 minutes, et les taux de CCM de ces deux traitements ne différaient pas. Il est à noter qu’une dilution supplémentaire des billes de l’aérosol (1/4x pendant 5 min, Fig. 5B) n’a pas entraîné d’augmentation supplémentaire du MCC. Ainsi, si trop de billes sont aérosolisées, elles semblent submerger le processus de transport et beaucoup ne se dégagent pas. Cependant, même lorsqu’une masse optimale de billes a été aérosolisée sur les voies respiratoires, certaines billes ont adhéré aux parois dans de nombreuses préparations. De nombreux autres chercheurs ont signalé l’échec de la clairance des billes/particules dans la trachée murine8,16,29.
En revanche, alors que la taille et les formes des radeaux de billes étaient variables au sein d’une souris et entre les souris, nous n’avons pas détecté de différence dans le taux de transport en fonction de la taille du radeau. D’autres ont également noté que le MCC était indépendant de la taille et de la forme des particules, mais qu’il était influencé par la propriété matérielle des particules transportées31,32.
La solution saline hypertonique a été signalée comme augmentant le volume du liquide de surface des voies respiratoires en attirant osmotiquement le liquide dans les voies respiratoires et a été utilisée en clinique pour restaurer/accélérer le MCC18,19. Bien que nous n’ayons pas constaté d’effet significatif de la solution saline élevée sur le taux de CMC, nous avons noté que le taux de CMC s’est maintenu pendant la période de mesure de 10 minutes dans le groupe à solution saline élevée, alors que le taux de CMC a diminué après 5 minutes dans le groupe témoin. Ces données sont similaires à celles rapportées par Donnelley et al.16, qui ont observé que même si leur groupe à forte teneur en sel ne présentait pas un taux de CMC plus élevé que les témoins traités avec une solution saline isotonique, le taux de CMC était maintenu pendant des périodes plus longues dans le groupe à forte teneur en sel, ce qui suggère une augmentation temporaire de l’hydratation de la surface des voies aériennes. Il est à noter que les études de Donnelley et al. ont été réalisées en présence d’un bloqueur de canal Na+ ajouté au groupe à forte teneur en sel. Comme nos études ont été réalisées sans l’ajout d’un bloqueur de canal Na+, cela soutient l’hypothèse que la solution saline hypertonique en soi peut restaurer le léger déclin de la CMC observé après une aérosolisation de 5 minutes avec une solution saline isotonique. La raison pour laquelle moins de radeaux de billes ont été comptés dans le groupe à forte teneur en sel n’est pas claire, car il ne semble pas y avoir plus de particules stationnaires ni de différence de taille des radeaux par rapport au groupe isotonique de 5 min.
Comme il a été démontré que les nucléotides augmentent la CMC en augmentant le CBF, le liquide de surface des voies aériennes et la sécrétion de mucus33, nous avons étudié l’effet de l’UTP lorsqu’il est inclus dans l’aérosol isotonique de 5 min avec les billes de suivi. Nous avons constaté qu’un aérosol de 5 minutes de PTU augmentait de manière significative le taux d’élimination des billes, ce qui suggère qu’une dose de PTU suffisante pour modifier la CMC était aérosolisée à la surface des voies respiratoires. D’après les études précédentes, il est probable que les trois composants du système de clairance mucociliaire (fréquence des battements ciliaires, sécrétion de mucine et hydratation de la surface des voies respiratoires) ont été stimulés par les PTU pour entraîner une augmentation globale du MCC. Ainsi, notre technique sera particulièrement utile pour tester diverses préparations pharmacologiques susceptibles d’affecter le MCC.
Enfin, notre méthode d’aérosolisation a été utilisée pour mesurer avec succès le MCC chez des souriceaux néonatals de 10 jours. Ainsi, cette méthode sera utile pour étudier le MCC pendant le développement ou dans des modèles de maladie dans lesquels certaines des mutations qui perturbent le MCC se sont avérées entraîner une létalité néonatale11,28.
En résumé, nous avons mis au point une méthode simple et peu coûteuse pour déterminer le MCC chez les souris in vivo (voir le tableau supplémentaire S1 pour les paramètres optimaux pour les mesures du MCC tels que déterminés dans cette étude). Notre méthode utilise l’aérosolisation et le suivi trans-trachéal de billes fluorescentes pour la détermination du MCC et présente un certain nombre d’avantages par rapport aux autres méthodes de MCC rapportées dans la littérature. Premièrement, il n’est pas nécessaire d’ouvrir la trachée (ou de l’intuber) pour introduire le traceur, et seul un très petit volume de liquide est inhalé avec les billes traceuses, ce qui réduit la probabilité de perturber le milieu du liquide de surface des voies aériennes. Deuxièmement, nous pouvons réellement visualiser le comportement des billes pendant l’élimination, ce qui peut fournir des informations supplémentaires sur les changements introduits par une intervention particulière, c’est-à-dire les modèles de migration, l’agglutination et/ou la déviation des trajectoires uniformes, en plus d’un taux réel de CMC. Troisièmement, nous avons utilisé avec succès cette méthode pour étudier le MCC chez de très jeunes souriceaux. De plus, comme cette méthode n’est pas nécessairement terminale, elle peut être réalisée sur des souris vivantes et elle peut être utilisée pour étudier le MCC avant et après le traitement médicamenteux. De plus, nous obtenons des taux de MCC presque identiques sur des souris vivantes ou après euthanasie. Enfin, l’équipement requis pour ces études est relativement peu coûteux et facile à obtenir et, espérons-le, permettra aux laboratoires qui étudient les perturbations des composants du système MCC de mesurer réellement le MCC chez ces souris.