Mucociliary Clearance in Mice Measured by Tracking Trans-tracheal Fluorescence of Nasally Aerosolized Beads

A genetikailag módosított egerek megjelenésével, lehetővé vált az MCC-rendszer mindhárom komponensének (csillószőrverés, nyálkatermelés és légúti felszíni hidratáció) izolált vizsgálata annak meghatározása érdekében, hogy ezek hogyan hatnak egymásra a normális MCC érdekében. Ahhoz azonban, hogy megérthessük az MCC rendszer komponensei közötti összefüggéseket, kritikus fontosságú, hogy pontosan meg tudjuk mérni az MCC arányát egerekben.

Míg számos tanulmány mérte az MCC-t egerekben különböző technikákkal, sok tanulmánynak vannak technikai hiányosságai, és az MCC arányok széles skáláját jelentették. A szakirodalomban a “normál egértrachea” esetében a légcső MCC (vagy részecsketranszport) sebessége a 15 mm/perc6 és 0,031 mm/perc21 között széles skálán mozog. A jelentett eltérések nagy része valószínűleg az MCC mérésére használt technikák különbözőségéből adódik, más tényezők (pl. egértörzs, életkor stb.) mellett8,14.

A legkorábbi tanulmányok egyike az élő egerek ép légcsövében mért MCC-t úgy mérte, hogy ~3 μm-es fluoreszcens gyöngyöket juttatott az orrüregbe (15 µl térfogat), majd a leszívott gyöngyök transz-tracheális fluoreszcenciája alapján mérte a részecskék transz-tracheális transzportját8. Ez a vizsgálat megállapította, hogy sok egér nem mutatott MCC-t, és sok gyöngy “stop/go” típusú transzportot mutatott. Ez a vizsgálat azt is megállapította, hogy a vizsgált egerek törzse jelentősen befolyásolta az MCC arányát. Mások élő egérben szcintigráfiával mértek alacsonyabb légúti tisztulást, miután nagy mennyiségű (~50 μl) gammasugárzó anyagot juttattak a légutakba9. Mindkét vizsgálatban problémát jelent, hogy viszonylag nagy mennyiségű folyadékot csepegtettek a légutakba és megzavarták a légúti felszíni folyadék mennyiségét, ami bizonyítottan megváltoztatja az MCC-t8,13,22.

A szakirodalomban számos olyan vizsgálat található, amelyben az MCC-t nyitott egér légcsőben mérték21,23,24. Bár technikailag ez az MCC-technika lehet a legegyszerűbb, valószínűleg ez a legproblémásabb a hőmérséklet és a normál légúti hidratáció fenntartásának nehézségei miatt, amelyek mindkettő kritikusan fontosak a normál MCC szempontjából. Az ilyen készítmények esetében jelentett MCC sebességek 0,031 mm/perc és 4,5 mm/perc között mozognak21,24. Az MCC-t egérben egy kivágott tüdőpreparátumban is mérték25 , de ez a módszer is nagy mennyiségű folyadékot használt, hasonlóan a nyitott légcsőpreparátumokhoz, a kivágott tüdő jelentős elárasztásával, ami valószínűleg zavarja a normál MCC-t.

Egy in vivo mikrodialízis technikát sikeresen alkalmaztak az egér alsó légútjainak genetikai manipulációjából eredő MCC zavarok azonosítására11. E technika során egy nagyon kicsi mikrodialízis-szondát helyeznek a légutak felszínére13 , és kis mennyiségű nyomjelzőt (250 nl) adnak distalisan a légúti epitéliumhoz. A festéknek a szondához való eljutásához szükséges időt rögzítik, és kiszámítják az MCC-t. Bár ez a technika minimalizálja a légúti felszínhez hozzáadott exogén folyadék mennyiségét, némileg időigényes, kis nyílást kell a légcsőbe helyezni, és a szonda elhelyezése megzavarhatja az MCC-t.

Egy másik technika, amelyet nagyon sikeresen alkalmaztak az MCC vizsgálatára számos genetikailag módosított egéren, ismert mennyiségű fluoreszcens gyöngyöt helyez egy nagyon kis folyadékmintába (~150 nl) közvetlenül az alsó légcsőbe/főhörgőkbe14,26,27,28 . 15 perc elteltével megszámoljuk a légcsőben/főhörgőkben maradt gyöngyöket, és kiszámítjuk a százalékos kiürülést. Bár a gyöngyök bevezetéséhez csak egy nagyon kis bemetszést ejtünk a felső légcsőben, nem lehet teljes bizonyossággal kijelenteni, hogy a légutak felszíni folyadékmiliőjét nem zavarja meg a gyöngyszállító kanül átmeneti elhelyezése vagy a gyöngyök bevezetéséhez használt kis mennyiségű folyadék. Emellett, bár úgy tűnik, hogy ezek a vizsgálatok jó clearance-adatokat szolgáltatnak, és egyértelmű különbségeket mutatnak az MCC-ben a WT és a várhatóan az MCC-t zavaró mutációkkal rendelkező egerek között14,26,27,28 , a tényleges clearance-értékeket ezzel a technikával nem kapjuk meg.

Az MCC mérésének optimálisabb technikája a tracer élő egérbe történő bevezetését jelenti a légcső megnyitása nélkül és a tracer követését a zárt légcsövön keresztül. Erről Donnelley és munkatársai számoltak be16 , de az ő technikájukhoz az egér intubálására volt szükség a nyomkövetéshez szükséges száraz por bejuttatásához és a képalkotáshoz drága berendezésre (szinkrotron), amely a világon csak néhány helyen áll rendelkezésre. Ezzel a beállítással az MCC alapsebessége nagyon alacsony volt (0,27 mm/perc), és a részecskék többsége helyhez kötött volt, ami valószínűleg a légutak kiszáradását tükrözi, mivel az intubált egereket FlexVent ventilátorral lélegeztették, és valószínűleg száraz levegőt lélegeztek. Amikor az egereket 2,5 percig izotóniás NaCl-lal aeroszolizálták a részecskék beszívását követően, az MCC sebessége jelentősen megnőtt, és 2-3 mm/perc tartományban volt, ami nem különbözik attól, amit a jelen vizsgálatban mértünk (az átlagos MCC izotóniás NaCl-lel a mi vizsgálatunkban 3,3 mm/perc volt).

A közelmúltban jelent meg egy tanulmány, amelyben intubáció nélküli in vivo képalkotást használtak kétfoton-mikroszkópiával az MCC mérésére egerekben29. A szerzők valóban azt találták, hogy az intubálás jelentősen megzavarta a pontos MCC-mérést, ezért arra a következtetésre jutottak, hogy ezt az eljárást kerülni kell az egér MCC-vizsgálatokban. Ezért viszonylag nagy mennyiségű folyadék (20 µl) felhasználásával oropharyngealis aspirációval juttatták be a nyomjelzőt a légutakba. A mi vizsgálatunkban megfigyeltekhez hasonlóan Veres és munkatársai arról számolnak be, hogy a fluoreszcens gyöngyök (0,5 um átmérőjűek) aggregált raftokat képeztek, amelyeket nyomon követtek az MCC összsebességének (~1,1 mm/perc) meghatározásához. Bár a Veres és munkatársai által a légcső vizualizációra való előkészítéséhez használt módszer nagyon hasonló volt a mi vizsgálatainkban használt módszerhez, a kétfotonos mikroszkópiával történő képalkotás sokkal bonyolultabb és költségesebb berendezést igényelt a mi módszerünkhöz képest, amely csak egy CCD-kamerával és fluoreszcens megvilágítással összekapcsolt bonctávcsövet igényel.

A mi módszerünk az MCC mérésére a nyomjelzőt nazális aeroszol belégzéssel juttatja be, nagyon kis mennyiségű folyadékot juttatva a légutakba (0,095 µl/5 perces aeroszol), és a légcső az MCC mérések során zárt és ép marad. Fontos, hogy azt találtuk, hogy az MCC aránya közel azonos volt élő egereknél vagy röviddel az eutanázia után. Ez meglehetősen meglepő volt, mivel feltételeztük, hogy az eutanázia adrenerg stimulációt (vagy más neurotranszmitterek felszabadulását) okozhat, amely stimulálhatja az MCC-t30. Az eutanáziás egerek légzési ingadozásának hiánya megkönnyíti a részecskék képalkotását, és így az MCC mérések nem élő egereken technikailag egyszerűbbek lehetnek, mint az ilyen mérések elvégzése lélegző állatokon.

Nem találtunk jelentős hatást az izoflurán anesztézia hosszának (5 vagy 25 perc) az MCC sebességére. Vizsgálataink többségét izoflurán-anesztéziával altatott egerekkel végeztük, de mivel nem biztos, hogy mindig rendelkezésre áll dedikált porlasztó, és az izoflurán és az aeroszol egyidejű adagolása kihívást jelenthet, egy sor vizsgálatot végeztünk az Avertin nevű injektálható érzéstelenítővel, amely széles körben elérhető és nem szabályozott az FDA által, mint sok injektálható érzéstelenítő. Az MCC aránya nem különbözött a két érzéstelenítő között. Bár az Averetinnel altatott egereknél megszámolt gyöngysodronyok száma valamivel kevesebb volt, mint az izoflurános csoportban, ez a különbség nem volt szignifikáns. Megjegyzendő, hogy az izoflurán-anesztetizált csoportban szignifikánsan több gyöngyszem tapadt a légcső falához, és az Avertin egerekben a gyöngyszem-tutajok szignifikánsan kisebbek voltak, mint az izoflurános egerekben. Feltételezésünk szerint ezek a különbségek a két egércsoport tüdejében lerakódott gyöngyök mennyiségében vagy lerakódási mintázatában mutatkozó különbségeknek tudhatók be, különösen mivel a légzésszám és a légzési térfogat különbözött a két érzéstelenítést kapott egerek között.

Az aeroszolizáció hossza jelentősen befolyásolta az MCC arányát, és megállapítottuk, hogy ez a bejuttatott gyöngyök tömegének köszönhető, a rövidebb aeroszolizációs periódusok (5 perc) nagyobb MCC arányt eredményeztek, mint a hosszabb aeroszolizációk (15 perc). Nem valószínű, hogy a folyadék adagolásában mutatkozó különbség magyarázza az eredményeket, mivel az 1/3x gyöngyökkel 15 percig aeroszolizált egerek ~3-szor annyi folyadékot kaptak, mint az 5 percig 1x gyöngyöt kapó egerek, és a két kezelés MCC rátája nem különbözött. Megjegyzendő, hogy az aeroszol gyöngyök további hígítása (1/4x 5 percig, 5B. ábra) nem eredményezte az MCC további növekedését. Ha tehát túl sok gyöngyöt aeroszolizálunk, úgy tűnik, hogy azok túlterhelik a transzportfolyamatot, és sokan nem tisztulnak ki. Azonban még akkor is, amikor optimális mennyiségű gyöngyöt aeroszolizáltak a légutakra, a gyöngyök egy része számos preparátumban megtapadt a falakon. Számos más kutató számolt be arról, hogy a gyöngyök/részecskék nem tisztulnak ki az egerek légcsövében8,16,29.

Ezzel szemben, bár a gyöngytutajok mérete és alakja változó volt egy egéren belül és az egerek között, nem észleltünk különbséget a transzport sebességében a tutajok méretének függvényében. Mások is megállapították, hogy az MCC független volt a részecskék méretétől és alakjától, de befolyásolta a szállított részecskék anyagi tulajdonsága31,32.

A hipertóniás sóoldatról beszámoltak, hogy növeli a légúti felszíni folyadék mennyiségét azáltal, hogy ozmotikusan folyadékot vonz a légutakba, és klinikailag az MCC helyreállítására/gyorsítására használják18,19. Bár nem tapasztaltuk a magas sótartalom szignifikáns hatását az MCC sebességére, megjegyeztük, hogy a magas sótartalmú csoportban az MCC sebessége a 10 perces mérési időszak alatt megmaradt, míg a kontrollcsoportban az MCC sebessége 5 perc után csökkent. Ezek az adatok hasonlóak a Donnelley és munkatársai16 által közölt adatokhoz, akik megfigyelték, hogy bár a magas sótartalmú csoportjukban nem volt nagyobb az MCC aránya az izotóniás sóoldattal kezelt kontrollcsoporthoz képest, az MCC aránya hosszabb ideig fennmaradt a magas sótartalmú csoportban, ami a légúti felszíni hidratáció átmeneti növekedésére utal. Megjegyzendő, hogy Donnelley és munkatársai vizsgálatai a magas sótartalmú csoporthoz adott Na+ -csatorna-blokkoló jelenlétében történtek. Mivel a mi vizsgálatainkat Na+ csatorna-blokkoló hozzáadása nélkül végeztük, ez alátámasztja azt a hipotézist, hogy a hipertóniás sóoldat önmagában képes helyreállítani az MCC-ben az izotóniás sóoldattal történő 5 perces aeroszolizációt követően megfigyelt enyhe csökkenést. Nem világos, hogy a magas sótartalmú csoportban miért számoltak kevesebb gyöngytutajt, mivel nem tűnt úgy, hogy több helyhez kötött részecske lenne, és a tutajok mérete sem különbözött az 5 perces izotóniás csoporthoz képest.

Mivel a nukleotidok bizonyítottan növelik az MCC-t a CBF, a légúti felszíni folyadék és a nyálkaszekréció növelése révén33 , megvizsgáltuk az UTP hatását, ha az izotóniás 5 perces aeroszolban a nyomkövető gyöngyökkel együtt szerepel. Azt találtuk, hogy az 5 perces UTP aeroszol jelentősen megnövelte a gyöngyök kiürülésének sebességét, ami arra utal, hogy az MCC módosításához elegendő UTP-dózis aeroszolizálódott a légúti felszínekre. Korábbi tanulmányok alapján valószínű, hogy a mucociliaris clearance rendszer mindhárom komponensét (ciliaris verésfrekvencia, mucinszekréció és légúti felszíni hidratáció) stimulálta az UTP, ami az MCC általános növekedését eredményezte. Így technikánk különösen hasznos lesz különböző farmakológiai készítmények tesztelésére, amelyek hatással lehetnek az MCC-re.

Végezetül, aeroszolizációs módszerünket sikeresen alkalmaztuk az MCC mérésére 10 napos újszülött egérkölykökben. Így ez a módszer hasznos lesz az MCC tanulmányozására a fejlődés során vagy olyan betegségmodellekben, amelyekben az MCC-t perturbáló mutációk némelyike újszülöttkori letalitást eredményez11,28.

Összefoglalva, egy egyszerű, olcsó módszert fejlesztettünk ki az MCC in vivo meghatározására egerekben (lásd az S1. kiegészítő táblázatban az MCC mérések optimális paramétereit, amelyeket ebben a vizsgálatban határoztunk meg). Módszerünk az MCC meghatározásához fluoreszcens gyöngyök aeroszolizációját és transz-tracheális követését alkalmazza, és számos előnnyel rendelkezik az irodalomban ismertetett más MCC-módszerekkel szemben. Először is, a tracheát nem kell megnyitni (vagy intubálni) a nyomjelző bevezetéséhez, és csak nagyon kis mennyiségű folyadékot lélegzünk be a nyomjelző gyöngyökkel együtt, ami csökkenti a légúti felszíni folyadék miliőjének megzavarásának valószínűségét. Másodszor, ténylegesen vizualizálni tudjuk a gyöngyök viselkedését a kiürítés során, ami az MCC tényleges sebességén kívül további információkat szolgáltathat az adott beavatkozás által bevezetett változásokról, azaz a vándorlási mintázatokról, a csomósodásról és/vagy az egyenletes pályától való eltérésről. Harmadszor, sikeresen alkalmaztuk ezt a módszert az MCC vizsgálatára nagyon fiatal egérkölykökben. Továbbá, mivel ez a módszer nem feltétlenül terminális, élő egereken is elvégezhető, és felhasználható a gyógyszeres kezelés előtti és utáni MCC vizsgálatára. Ráadásul az MCC közel azonos arányát kapjuk az élő és az elaltatás utáni egereken. Végül, az ezekhez a vizsgálatokhoz szükséges berendezések viszonylag olcsók és könnyen beszerezhetők, és remélhetőleg lehetővé teszik majd az MCC rendszer összetevőinek perturbációit vizsgáló laboratóriumoknak, hogy ténylegesen mérjék az MCC-t ezeken az egereken.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.