Med tillkomsten av genetiskt manipulerade möss, är det nu möjligt att studera var och en av de tre komponenterna i MCC-systemet (ciliär slag, slemproduktion och hydrering av luftvägarnas yta) isolerat för att fastställa hur de interagerar för att åstadkomma normal MCC. För att vi ska kunna förstå det ömsesidiga sambandet mellan komponenterna i MCC-systemet måste vi dock kunna mäta MCC-frekvensen hos möss på ett korrekt sätt.
Vidare ett antal studier har mätt MCC hos möss med hjälp av olika tekniker, men många av studierna har tekniska brister, och ett brett spektrum av MCC-frekvenser har rapporterats. Hastigheterna för trakeal MCC (eller partikeltransport) för ”normal mus-trakea” som rapporteras i litteraturen varierar kraftigt från 15 mm/min6 till 0,031 mm/min21. En stor del av den rapporterade variationen beror sannolikt på skillnader i de tekniker som används för att mäta MCC, utöver andra faktorer (t.ex. musstam, ålder etc.)8,14.
En av de tidigaste studierna som rapporterades mätte MCC i intakta luftstrupar hos levande möss genom att introducera ~3 μm fluorescerande pärlor i näshålan (15 µl volym) och sedan mäta transporten av de insugna pärlorna genom transtrakeal fluorescens av partiklarna8. Denna studie visade att många möss inte uppvisade någon MCC och att många pärlor uppvisade en ”stop/go”-typ av transport. I studien konstaterades också att den studerade musstammen påverkade hastigheten av MCC avsevärt. Andra har mätt den lägre clearance i luftvägarna hos levande möss genom scintigrafi efter instillation av en stor volym (~50 μl) av en gammastrålare i luftvägarna9. Båda dessa studier lider av att de instillerar en relativt stor volym vätska i luftvägarna och stör volymen vätska på luftvägarnas yta, vilket har visat sig förändra MCC8,13,22.
Det finns ett antal studier i litteraturen där MCC mättes i den öppna luftstrupen hos mus21,23,24. Även om denna MCC-teknik kan vara tekniskt sett den enklaste, är den sannolikt den mest problematiska på grund av svårigheten att upprätthålla temperaturen och normal luftvägshydrering, som båda är av avgörande betydelse för normal MCC. De MCC-hastigheter som rapporterats för dessa preparat varierar från 0,031 mm/min till 4,5 mm/min21,24. MCC i musen har också mätts i ett preparat av en exciderad lunga25, men denna metod använde också stora vätskemängder, vilket liknar de öppna trakealpreparaten, med en markant översvämning av den exciderade lungan, vilket troligen stör den normala MCC.
En in vivo-mikrodialysteknik har använts med framgång för att identifiera störningar i MCC på grund av genetisk manipulering i de nedre luftvägarna hos musen11. Tekniken innebär att man placerar en mycket liten mikrodialyssond på luftvägsytan13 och att en liten volym spårämne (250 nl) tillsätts distalt i luftvägsepitelet. Den tid det tar för färgämnet att nå sonden registreras och MCC beräknas. Även om denna teknik minimerar mängden exogen vätska som tillsätts till luftvägsytan är den något tidskrävande, kräver att man placerar en liten öppning i luftstrupen och placeringen av sonden kan störa MCC.
En annan teknik som har använts med stor framgång för att studera MCC på ett antal genetiskt manipulerade möss innebär att man placerar en känd mängd fluorescerande pärlor i ett mycket litet vätskeprov (~150 nl) direkt i den nedre luftstrupen/mainstam bronkerna14,26,27,28. Efter 15 minuter räknas de kulor som är kvar i luftstrupen/mainstem bronkerna och den procentuella clearanceprocenten beräknas. Även om endast ett mycket litet snitt görs i den övre luftstrupen för att föra in pärlorna, kan man inte med säkerhet säga att luftvägarnas ytvätskemiljö inte störs av den tillfälliga placeringen av kanylen för tillförsel av pärlor eller av den lilla vätskemängd som används för att föra in pärlorna. Även om dessa studier verkar ge bra data om clearance och ger tydliga skillnader i MCC mellan WT och möss med mutationer som förväntas störa MCC14,26,27,28, erhålls inte den faktiska clearancehastigheten med denna teknik.
En mer optimal teknik för att mäta MCC skulle innebära att en spårämne introduceras i en levande mus utan att luftstrupen öppnas och att spårämnet spåras genom den stängda luftstrupen. Detta har rapporterats av Donnelley et al.16, men deras teknik krävde intubation av musen för att leverera ett torrt pulver för spårning och dyr utrustning för avbildning (en synkrotron) som endast finns tillgänglig på ett fåtal platser i världen. Med denna uppställning var basalhastigheten för MCC mycket låg (0,27 mm/min) och majoriteten av partiklarna var stationära, vilket sannolikt återspeglar uttorkning av luftvägarna eftersom de intuberade mössen ventilerades med en FlexVent och sannolikt andades torr luft. När mössen aerosoliserades i 2,5 minuter med isotonisk NaCl efter partikelinsufflation ökade MCC-hastigheten avsevärt och låg i intervallet 2-3 mm/min, vilket inte är olikt vad vi mätte i den aktuella undersökningen (genomsnittlig MCC med isotonisk NaCl i vår studie var 3,3 mm/min).
Redan nyligen publicerades en studie där man använde intubationsfri in vivo avbildning med hjälp av två-fotonmikroskopi för att mäta MCC hos möss29. Författarna fann faktiskt att intubation påtagligt störde noggrann MCC-mätning och drog därför slutsatsen att detta förfarande bör undvikas i MCC-studier på möss. De införde därför spårämnet i luftvägarna genom orofaryngeal aspiration med hjälp av en relativt stor vätskevolym (20 µl). I likhet med vad vi observerade i vår studie rapporterar Veres et al. att de fluorescerande pärlorna (0,5 um i diameter) bildade aggregerade flottar, som de följde för att bestämma den totala MCC-hastigheten (~1,1 mm/min). Även om den metod som Veres et al. använde för att förbereda luftröret för visualisering var mycket lik den som användes i våra studier, krävde avbildning med tvåfotonmikroskopi en mer genomarbetad och kostsam uppställning jämfört med vår metod, som endast kräver ett dissektionsskåp kopplat till en CCD-kamera och fluorescerande belysning.
Vår metod för att mäta MCC levererar spårämnet via inhalation av nasala aerosoler, vilket ger en mycket liten vätskevolym till luftvägarna (0,095 µl/5-min aerosol), och luftstrupen förblir stängd och intakt för MCC-mätningarna. Viktigt är att vi fann att MCC-frekvensen var nästan identisk hos levande möss eller kort efter avlivning. Detta var ganska överraskande eftersom vi spekulerade att eutanasi skulle kunna orsaka adrenergisk stimulering (eller frisättning av andra neurotransmittorer) som skulle kunna stimulera MCC30. Avsaknaden av andningsexkursion hos avlivade möss underlättar partikelavbildning, och därför kan MCC-mätningar på en mus som inte lever vara tekniskt enklare än att utföra sådana mätningar på ett djur som andas.
Vi fann ingen signifikant effekt av längden på isofluranananestesin (5 eller 25 minuter) på hastigheten av MCC. De flesta av våra studier genomfördes med möss som sövdes med isofluranbedövning, men eftersom tillgång till en dedikerad förångare kanske inte alltid är tillgänglig och samtidig tillförsel av isofluran och en aerosol kan vara en utmaning, genomförde vi en uppsättning studier med hjälp av det injicerbara bedövningsmedlet Avertin, som är allmänt tillgängligt och inte FDA-reglerat, vilket är fallet med många injicerbara bedövningsmedel. MCC-frekvensen skiljde sig inte åt mellan de två narkosmedlen. Även om antalet pärlflottar som vi räknade i de Avertin-bedövade mössen var något mindre än i isoflurangruppen var denna skillnad inte signifikant. Noterbart är att betydligt fler pärlor fäste sig vid luftrörsväggarna i den isofluranbedövade gruppen och att pärlflottarna i Avertin-mössen var betydligt mindre än i isofluran-mössen. Vi antar att dessa skillnader kan bero på skillnader i mängden pärlor som deponerats i lungorna hos de två grupperna av möss, eller i deras deponeringsmönster, särskilt eftersom andningsfrekvensen och tidalvolymerna skiljde sig åt mellan de möss som fick de två narkosmedlen.
Längden på aerosoliseringen hade en signifikant effekt på hastigheten av MCC, och vi fastställde att detta berodde på den tillförda massan av pärlor, med kortare aerosoliseringsperioder (5 min) som gav större hastighet av MCC än längre aerosoliseringar (15 min). Det är osannolikt att en skillnad i vätsketillförsel förklarar resultaten eftersom möss som aerosoliserats med 1/3x pärlor i 15 min fick ~3 gånger så mycket vätska som möss som fick 1x pärlor i 5 min, och hastigheten av MCC för dessa två behandlingar skiljde sig inte åt. Noterbart är att ytterligare utspädning av aerosolpärlorna (1/4x i 5 min, fig. 5B) inte resulterade i någon ytterligare ökning av MCC. Om för många pärlor aerosoliseras verkar de alltså överväldiga transportprocessen och många försvinner inte. Även när en optimal massa pärlor aerosoliserades på luftvägarna, fastnade dock en del av pärlorna vid väggarna i många av preparaten. Många andra forskare har rapporterat att pärlor/partiklar inte klarar sig i murins luftstrupe8,16,29.
Däremot, även om pärlflottarnas storlek och form varierade inom en mus och mellan olika möss, upptäckte vi ingen skillnad i transporthastigheten som en funktion av flottstorleken. Andra har också noterat att MCC var oberoende av partikelstorlek och form men påverkades av de transporterade partiklarnas materialegenskaper31,32.
Hypertonisk saltlösning har rapporterats öka volymen av ytvätska i luftvägarna genom att osmotiskt dra in vätska i luftvägarna och har använts kliniskt för att återställa/accelerera MCC18,19. Även om vi inte såg någon signifikant effekt av det höga saltet på MCC-hastigheten, noterade vi att MCC-hastigheten bibehölls under mätperioden på 10 minuter i gruppen med högt salt, medan MCC-hastigheten sjönk efter 5 minuter i kontrollgruppen. Dessa uppgifter liknar dem som rapporterats av Donnelley et al.16 , som observerade att även om deras grupp med hög salthalt inte uppvisade en högre MCC-hastighet jämfört med kontroller som behandlades med isotonisk koksaltlösning, bibehölls MCC-hastigheten under längre tidsperioder i gruppen med hög salthalt, vilket tyder på en tillfällig ökning av luftvägsytans hydratisering. Noterbart är att Donnelley et al:s studier utfördes i närvaro av en Na+-kanalblockerare som tillsattes till gruppen med hög salthalt. Eftersom våra studier utfördes utan tillsats av en Na+ kanalblockerare stöder detta hypotesen att hypertonisk saltlösning i sig kan återställa den svaga nedgång i MCC som observerats efter 5 minuters aerosolering med isotonisk saltlösning. Det är inte klart varför färre pärlflottar räknades i gruppen med hög salthalt, eftersom det inte verkade finnas fler stationära partiklar eller någon skillnad i storlek på flottarna jämfört med den isotona 5-minutersgruppen.
Då nukleotider har visats öka MCC genom att öka CBF, vätska på luftvägarnas yta och slemutsutsöndring33 undersökte vi effekten av UTP när det inkluderades i den isotona 5-minuters aerosolen tillsammans med spårningspärlorna. Vi fann att en 5-minuters aerosol av UTP signifikant ökade hastigheten för borttagning av pärlor, vilket tyder på att en dos av UTP som är tillräcklig för att modifiera MCC aerosolerades till luftvägsytorna. Baserat på tidigare studier är det troligt att alla tre komponenterna i det mukociliära clearance-systemet (ciliär slagfrekvens, mucinutsöndring och hydrering av luftvägsytan) stimulerades av UTP för att resultera i en övergripande ökning av MCC. Vår teknik kommer därför att vara särskilt användbar för att testa olika farmakologiska preparat som kan påverka MCC.
För det sista har vår aerosoliseringsmetod använts för att framgångsrikt mäta MCC hos 10 dagar gamla neonatala musungar. Således kommer denna metod att vara användbar för att studera MCC under utveckling eller i sjukdomsmodeller där vissa mutationer som stör MCC har visat sig resultera i neonatal dödlighet11,28.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en enkel och billig metod för att bestämma MCC hos möss in vivo (se tilläggstabell S1 för optimala parametrar för MCC-mätningar som bestämts i denna studie). Vår metod använder aerosolering och trans-trakeal spårning av fluorescerande pärlor för MCC-bestämning och har ett antal fördelar jämfört med andra MCC-metoder som rapporterats i litteraturen. För det första behöver luftstrupen inte öppnas (eller intuberas) för introduktion av spårämnet, och endast en mycket liten volym vätska inhaleras med spårämnespärlorna, vilket minskar sannolikheten för störningar i miljön i luftvägens ytvätska. För det andra kan vi faktiskt visualisera pärlornas beteende under avföringen, vilket kan ge ytterligare information om de förändringar som införs genom ett visst ingrepp, dvs. migrationsmönster, klumpning och/eller avvikelse från enhetliga banor, utöver en faktisk MCC-hastighet. För det tredje har vi framgångsrikt använt denna metod för att studera MCC hos mycket unga musungar. Eftersom denna metod inte nödvändigtvis är terminal kan den dessutom utföras på levande möss och kan användas för att studera MCC före och efter läkemedelsbehandling. Dessutom får vi nästan identiska mängder MCC på levande möss eller möss som avlivats. Slutligen är den utrustning som krävs för dessa studier relativt billig och lätt att få tag på, vilket förhoppningsvis kommer att göra det möjligt för laboratorier som studerar störningar i komponenterna i MCC-systemet att faktiskt mäta MCC hos dessa möss.