Con la llegada de los ratones modificados genéticamente, ahora es posible estudiar cada uno de los tres componentes del sistema de CCM (latido ciliar, producción de moco e hidratación de la superficie de las vías respiratorias) de forma aislada para determinar cómo interactúan para afectar al CCM normal. Sin embargo, para poder comprender la interrelación entre los componentes del sistema de MCC es fundamental poder medir con precisión la tasa de MCC en ratones.
Aunque varios estudios han medido la MCC en ratones mediante diversas técnicas, muchos de los estudios presentan deficiencias técnicas y se informa de una amplia gama de tasas de MCC. Las tasas de MCC traqueal (o transporte de partículas) para la «tráquea de ratón normal» notificadas en la bibliografía difieren ampliamente, desde 15 mm/min6 hasta 0,031 mm/min21. Gran parte de la variabilidad notificada se debe probablemente a las diferencias en las técnicas utilizadas para medir la MCC, además de otros factores (por ejemplo, la cepa de los ratones, la edad, etc.)8,14.
Uno de los primeros estudios notificados midió la MCC en las tráqueas intactas de ratones vivos introduciendo perlas fluorescentes de ~3 μm en la cavidad nasal (15 µl de volumen) y midiendo después el transporte de las perlas aspiradas mediante la fluorescencia transtraqueal de las partículas8. Este estudio descubrió que muchos ratones no mostraban MCC y que muchas perlas mostraban un transporte de tipo «stop/go». Este estudio también descubrió que la cepa de los ratones estudiados influía significativamente en la tasa de MCC. Otros han medido el aclaramiento de las vías respiratorias inferiores en el ratón vivo mediante gammagrafía después de instilar un gran volumen (~50 μl) de un emisor gamma en las vías respiratorias9. Ambos estudios adolecen de la instilación de un volumen relativamente grande de líquido en las vías respiratorias y de la perturbación del volumen de líquido de la superficie de las vías respiratorias, que se ha demostrado que altera la MCC8,13,22.
Existen varios estudios en la literatura en los que se midió la MCC en la tráquea murina abierta21,23,24. Aunque esta técnica de CCM puede ser técnicamente la más fácil, es probablemente la más problemática debido a la dificultad de mantener la temperatura y la hidratación normal de las vías respiratorias, ambas de importancia crítica para una CCM normal. Las tasas de CCM comunicadas para estas preparaciones oscilan entre 0,031 mm/min y 4,5 mm/min21,24. La MCC en el ratón también se ha medido en una preparación de pulmón extirpado25, pero este método también utilizó grandes volúmenes de líquido, de forma similar a las preparaciones traqueales abiertas con una marcada inundación del pulmón extirpado, lo que probablemente perturba la MCC normal.
Se ha utilizado con éxito una técnica de microdiálisis in vivo para identificar las perturbaciones en la MCC debidas a la manipulación genética en las vías respiratorias inferiores del ratón11. Esta técnica consiste en colocar una sonda de microdiálisis muy pequeña en la superficie de las vías respiratorias13 y se añade un pequeño volumen de trazador (250 nl) distalmente al epitelio de las vías respiratorias. Se registra el tiempo necesario para que el colorante llegue a la sonda y se calcula la MCC. Aunque esta técnica minimiza la cantidad de líquido exógeno que se añade a la superficie de las vías respiratorias, consume algo de tiempo, requiere la colocación de una pequeña abertura en la tráquea y la colocación de la sonda puede perturbar la MCC.
Otra técnica que se ha utilizado con mucho éxito para estudiar la MCC en una serie de ratones modificados genéticamente implica la colocación de una cantidad conocida de perlas fluorescentes en una muestra de líquido muy pequeña (~150 nl) directamente en la tráquea inferior/bronquios principales14,26,27,28. Después de 15 minutos, se cuentan las perlas que quedan en la tráquea/bronquios principales y se calcula el porcentaje de eliminación. Aunque sólo se realiza una pequeña incisión en la parte superior de la tráquea para introducir las perlas, no se puede afirmar con certeza que el medio líquido de la superficie de las vías respiratorias no se vea alterado por la colocación transitoria de la cánula de administración de perlas o por el pequeño volumen de líquido utilizado para introducir las perlas. Además, aunque estos estudios parecen arrojar buenos datos de aclaramiento y proporcionan claras diferencias en el MCC entre WT y ratones con mutaciones que se espera que perturben el MCC14,26,27,28, las tasas reales de aclaramiento no se obtienen con esta técnica.
Una técnica más óptima para medir el MCC implicaría la introducción de un trazador en un ratón vivo sin abrir la tráquea y el seguimiento del trazador a través de la tráquea cerrada. Esto ha sido reportado por Donnelley et al.16, pero su técnica requirió la intubación del ratón para suministrar un polvo seco para el rastreo y un equipo costoso para las imágenes (un sincrotrón) que sólo está disponible en unos pocos lugares en el mundo. Con esta configuración, las tasas basales de MCC eran muy bajas (0,27 mm/min) y la mayoría de las partículas eran estacionarias, lo que probablemente refleja la desecación de las vías respiratorias, ya que los ratones intubados estaban ventilados con un FlexVent y probablemente respiraban aire seco. Cuando se aerosolizó a los ratones durante 2,5 minutos con NaCl isotónico después de la insuflación de partículas, la tasa de MCC aumentó significativamente y se situó en el rango de 2-3 mm/min, lo que no difiere de lo que medimos en la presente investigación (la media de MCC con NaCl isotónico en nuestro estudio fue de 3,3 mm/min).
Recientemente se publicó un estudio en el que se utilizaron imágenes in vivo sin intubación mediante microscopía de dos fotones para medir la MCC en ratones29. De hecho, los autores descubrieron que la intubación perturbaba notablemente la medición precisa del CCM y, por lo tanto, concluyeron que este procedimiento debía evitarse en los estudios de CCM murino. Por ello, introdujeron el trazador en las vías respiratorias por aspiración orofaríngea utilizando un volumen de líquido relativamente grande (20 µl). De forma similar a lo observado en nuestro estudio, Veres et al. informan de que las perlas fluorescentes (de 0,5 um de diámetro) formaron balsas de agregados, que rastrearon para determinar la tasa global de MCC (~1,1 mm/min). Aunque el método utilizado por Veres et al. para preparar la tráquea para su visualización era muy similar al utilizado en nuestros estudios, la obtención de imágenes con microscopía de dos fotones requería un montaje más elaborado y costoso en comparación con nuestro método, que sólo requiere un visor de disección interconectado con una cámara CCD e iluminación fluorescente.
Nuestro método para medir la MCC suministra el trazador a través de la inhalación de aerosoles nasales, añadiendo muy poco volumen de líquido a las vías respiratorias (0,095 µl/5 minutos de aerosol), y la tráquea permanece cerrada e intacta para las mediciones de la MCC. Es importante destacar que encontramos que la tasa de MCC era casi idéntica en los ratones vivos o poco después de la eutanasia. Esto fue bastante sorprendente, ya que especulamos que la eutanasia podría causar una estimulación adrenérgica (o la liberación de otros neurotransmisores) que podría estimular la MCC30. La ausencia de excursión respiratoria en los ratones eutanasiados facilita la obtención de imágenes de partículas y, por lo tanto, las mediciones de MCC en un ratón no vivo pueden ser técnicamente más fáciles que realizar dichas mediciones en un animal que respira.
No encontramos ningún efecto significativo de la duración de la anestesia con isoflurano (5 o 25 min) en la tasa de MCC. La mayoría de nuestros estudios se llevaron a cabo con ratones anestesiados con anestesia de isoflurano, pero como el acceso a un vaporizador dedicado podría no estar siempre disponible y la administración simultánea de isoflurano y un aerosol puede ser un reto, realizamos un conjunto de estudios utilizando el anestésico inyectable, Avertin, que está ampliamente disponible y no está regulado por la FDA, como muchos anestésicos inyectables. La tasa de MCC no fue diferente entre los dos anestésicos. Aunque el número de cuentas que contamos en los ratones anestesiados con Averetin fue ligeramente inferior al del grupo con isoflurano, esta diferencia no fue significativa. Cabe destacar que en el grupo anestesiado con isoflurano se adhirieron a las paredes de la tráquea un número significativamente mayor de microesferas y que las balsas de microesferas de los ratones con Avertin eran significativamente más pequeñas que las de los ratones con isoflurano. Nuestra hipótesis es que estas diferencias podrían deberse a diferencias en la cantidad de cuentas depositadas en los pulmones de los dos grupos de ratones, o en su patrón de deposición, especialmente porque la frecuencia respiratoria y los volúmenes tidales diferían entre los ratones que recibieron los dos anestésicos.
La duración de la aerosolización tuvo un efecto significativo en la tasa de MCC, y determinamos que esto se debía a la masa de perlas entregadas, con períodos de aerosolización más cortos (5 min) que dieron mayores tasas de MCC que las aerosolizaciones más largas (15 min). Es poco probable que una diferencia en el suministro de líquido explique los resultados, ya que los ratones a los que se les administró 1/3 de perlas durante 15 minutos recibieron aproximadamente 3 veces más líquido que los ratones que recibieron 1 perla durante 5 minutos, y las tasas de MCC de estos dos tratamientos no difirieron. Cabe destacar que una mayor dilución de las perlas en aerosol (1/4x durante 5 minutos, Fig. 5B) no dio lugar a un mayor aumento de la MCC. Por lo tanto, si se aerosolizan demasiadas perlas, parece que abruman el proceso de transporte y muchas no se despejan. Sin embargo, incluso cuando se aerosolizó una masa óptima de perlas en las vías respiratorias, algunas de las perlas se adhirieron a las paredes en muchas de las preparaciones. Muchos otros investigadores han informado de que las perlas/partículas no se despejan en la tráquea murina8,16,29.
En cambio, aunque el tamaño y las formas de las balsas de perlas eran variables dentro de un ratón y entre ratones, no detectamos una diferencia en la tasa de transporte en función del tamaño de la balsa. Otros han observado también que la MCC era independiente del tamaño y la forma de las partículas, pero estaba influida por la propiedad del material de las partículas transportadas31,32.
Salina hipertónica se ha informado de que aumenta el volumen de líquido de la superficie de las vías respiratorias al atraer osmóticamente el líquido a las vías respiratorias y se ha utilizado clínicamente para restaurar/acelerar la MCC18,19. Aunque no observamos un efecto significativo de la sal alta en la tasa de MCC, sí observamos que la tasa de MCC se mantuvo durante el período de medición de 10 minutos en el grupo de sal alta, mientras que la tasa de MCC disminuyó después de 5 minutos en el grupo de control. Estos datos son similares a los comunicados por Donnelley et al.16, que observaron que, aunque su grupo con alto contenido en sal no presentaba una mayor tasa de MCC en comparación con los controles tratados con solución salina isotónica, la tasa de MCC se mantuvo durante períodos más largos en el grupo con alto contenido en sal, lo que sugiere un aumento temporal de la hidratación de la superficie de las vías respiratorias. Cabe destacar que los estudios de Donnelley et al. se realizaron en presencia de un bloqueador de los canales de Na+ añadido al grupo con alto contenido en sal. Dado que nuestros estudios se realizaron sin la adición de un bloqueador del canal de Na+, esto apoya la hipótesis de que la solución salina hipertónica per se puede restaurar el ligero descenso del CCM observado tras la aerosolización de 5 minutos con solución salina isotónica. No está claro por qué se contaron menos balsas de cuentas en el grupo de sal alta, ya que no parecía haber más partículas estacionarias ni una diferencia en el tamaño de las balsas en comparación con el grupo isotónico de 5 minutos.
Como se ha demostrado que los nucleótidos aumentan la MCC al incrementar el CBF, el líquido de la superficie de las vías respiratorias y la secreción de moco33, investigamos el efecto de la UTP cuando se incluía en el aerosol isotónico de 5 minutos junto con las cuentas de seguimiento. Descubrimos que un aerosol de 5 minutos de UTP aumentaba significativamente la tasa de eliminación de microesferas, lo que sugiere que una dosis de UTP suficiente para modificar la MCC se aerosolizaba a las superficies de las vías respiratorias. Basándonos en estudios anteriores, es probable que los tres componentes del sistema de depuración mucociliar (la frecuencia de los latidos ciliares, la secreción de mucina y la hidratación de la superficie de las vías respiratorias), fueran estimulados por la UTP para dar lugar a un aumento general de la MCC. Por lo tanto, nuestra técnica será especialmente útil para probar diversas preparaciones farmacológicas que puedan afectar a la MCC.
Por último, nuestro método de aerosolización se ha utilizado para medir con éxito la MCC en crías de ratón neonatales de 10 días. Por lo tanto, este método será útil para estudiar la MCC durante el desarrollo o en modelos de enfermedad en los que se ha descubierto que algunas de las mutaciones que perturban la MCC dan lugar a la letalidad neonatal11,28.
En resumen, hemos desarrollado un método sencillo y barato para determinar la MCC en ratones in vivo (véase la Tabla Suplementaria S1 para los parámetros óptimos para las mediciones de la MCC determinadas en este estudio). Nuestro método utiliza la aerosolización y el seguimiento trans-traqueal de perlas fluorescentes para la determinación de MCC y tiene una serie de ventajas sobre otros métodos de MCC reportados en la literatura. En primer lugar, no es necesario abrir la tráquea (o intubarla) para introducir el trazador, y sólo se inhala un volumen muy pequeño de líquido con las perlas del trazador, lo que reduce la probabilidad de perturbar el medio del líquido de la superficie de las vías respiratorias. En segundo lugar, podemos visualizar realmente el comportamiento de las microesferas durante el aclaramiento, lo que puede proporcionar información adicional sobre los cambios introducidos por una intervención concreta, es decir, patrones de migración, aglomeración y/o desviación de trayectorias uniformes, además de una tasa real de MCC. En tercer lugar, hemos utilizado con éxito este método para estudiar el CCM en crías de ratón muy jóvenes. Además, como este método no es necesariamente terminal, puede realizarse en ratones vivos y puede utilizarse para estudiar el CCM antes y después del tratamiento farmacológico. Además, se obtienen tasas casi idénticas de CCM en ratones vivos o tras la eutanasia. Por último, el equipo necesario para estos estudios es relativamente barato y fácil de obtener y es de esperar que permita a los laboratorios que estudian las perturbaciones en los componentes del sistema MCC medir realmente el MCC en estos ratones.