Con l’avvento dei topi geneticamente modificati, è ora possibile studiare ciascuno dei tre componenti del sistema MCC (battito ciliare, produzione di muco e idratazione della superficie delle vie aeree) in modo isolato per determinare come interagiscono per avere un MCC normale. Tuttavia, fondamentale per la nostra capacità di comprendere l’interrelazione tra i componenti del sistema MCC è la capacità di misurare accuratamente il tasso di MCC nei topi.
Mentre un certo numero di studi hanno misurato MCC nei topi con una varietà di tecniche, molti degli studi hanno lacune tecniche e una vasta gamma di tassi MCC sono riportati. I tassi di MCC tracheale (o trasporto di particelle) per la “trachea normale del topo” riportati in letteratura differiscono ampiamente da 15 mm/min6 a 0,031 mm/min21. Gran parte della variabilità riportata è probabilmente dovuta alle differenze nelle tecniche utilizzate per misurare MCC, oltre ad altri fattori (ad esempio, ceppo di topi, età, ecc) 8,14.
Uno dei primi studi riportati misurato MCC nelle trachee intatte di topi vivi introducendo ~ 3 micron perline fluorescenti nella cavità nasale (15 µl di volume) e poi misurare il trasporto delle perle aspirate dalla fluorescenza trans-tracheale delle particelle 8. Questo studio ha trovato che molti topi esposti nessun MCC e molte perle esposte un tipo di trasporto “stop/go”. Questo studio ha anche trovato il ceppo di topi studiati significativamente influenzato il tasso di MCC. Altri hanno misurato la clearance delle vie aeree inferiore nel mouse vivente da scintigrafia dopo instillare un grande volume (~ 50 μl) di un emettitore gamma nelle vie aeree9. Entrambi questi studi soffrono di instillare un volume relativamente grande di liquido sulle vie aeree e perturbare il volume del liquido superficiale delle vie aeree, che ha dimostrato di alterare MCC 8,13,22.
Ci sono una serie di studi in letteratura in cui MCC è stato misurato nella trachea murina aperta 21,23,24. Anche se questa tecnica MCC può essere tecnicamente la più semplice, è probabilmente la più problematica a causa della difficoltà di mantenere la temperatura e la normale idratazione delle vie aeree, entrambi i quali sono di fondamentale importanza per una MCC normale. MCC tassi riportati per queste preparazioni vanno da 0,031 mm/min a 4,5 mm/min21,24. MCC nel topo è stato misurato anche in una preparazione polmone escisso 25, ma questo metodo utilizzato anche grandi volumi di liquido, simile alle preparazioni tracheali aperte con inondazione marcata del polmone escisso, probabilmente disturbando MCC normale.
Una tecnica di microdialisi in vivo è stato utilizzato con successo per identificare perturbazioni in MCC a causa di manipolazione genetica nelle vie aeree inferiori nel mouse 11. Questa tecnica prevede il posizionamento di una sonda molto piccola microdialisi sulla superficie delle vie aeree 13 e un piccolo volume di tracciante (250 nl) viene aggiunto distalmente all’epitelio delle vie aeree. Il tempo necessario al colorante per raggiungere la sonda viene registrato e calcolato l’MCC. Mentre questa tecnica riduce al minimo la quantità di liquido esogeno aggiunto alla superficie delle vie aeree, è un po ‘di tempo, richiede l’immissione di una piccola apertura nella trachea, e il posizionamento della sonda può perturbare MCC.
Un’altra tecnica che è stata utilizzata con molto successo per studiare MCC su un certo numero di topi geneticamente modificati comporta l’immissione di una quantità nota di perline fluorescenti in un campione molto piccolo liquido (~ 150 nl) direttamente nella trachea inferiore / bronchi principali 14,26,27,28. Dopo 15 min, le perle rimanenti nella trachea / bronchi del tronco sono contati e percentuale di clearance è calcolato. Mentre solo una piccola incisione è fatta nella trachea superiore per introdurre le perle, non si può affermare con certezza che il milieu liquido superficiale delle vie aeree non è disturbato dal posizionamento transitorio della cannula consegna tallone o il piccolo volume di liquido utilizzato per introdurre le perle. Inoltre, mentre questi studi sembrano produrre buoni dati di clearance e fornire chiare differenze in MCC tra WT e topi con mutazioni previste per perturbare MCC 14,26,27,28, i tassi effettivi di clearance non sono ottenuti con questa tecnica.
Una tecnica più ottimale per misurare MCC comporterebbe l’introduzione di un tracciante in un topo vivo senza aprire la trachea e tracciante attraverso la trachea chiusa. Questo è stato riportato da Donnelley et al.16, ma la loro tecnica ha richiesto l’intubazione del topo per fornire una polvere secca per il monitoraggio e attrezzature costose per l’imaging (un sincrotrone) che è disponibile solo in pochi posti nel mondo. Utilizzando questo set-up, i tassi basali di MCC erano molto bassi (0,27 mm/min) e la maggior parte delle particelle erano stazionarie, probabilmente riflettendo l’essiccazione delle vie aeree come i topi intubati erano ventilati con un FlexVent e probabilmente respirando aria secca. Quando i topi sono stati aerosolizzati per 2,5 min con NaCl isotonico dopo l’insufflazione di particelle, il tasso di MCC è aumentato significativamente ed era nell’intervallo di 2-3 mm/min, non dissimile da quello che abbiamo misurato nella presente indagine (MCC medio con NaCl isotonico nel nostro studio era 3,3 mm/min).
Uno studio è stato recentemente pubblicato in cui intubazione-free in vivo imaging utilizzando microscopia a due fotoni è stato utilizzato per misurare MCC nei topi29. Infatti, gli autori hanno trovato che intubazione marcatamente perturbato accurata misurazione MCC e quindi concluso che questa procedura dovrebbe essere evitata in studi MCC murino. Così hanno introdotto il tracciante nelle vie aeree tramite aspirazione orofaringea utilizzando un volume relativamente grande di liquido (20 µl). Simile a quello che abbiamo osservato nel nostro studio, Veres et al. riferiscono che le perle fluorescenti (0,5 um di diametro) hanno formato zattere aggregate, che hanno monitorato per determinare il tasso complessivo di MCC (~ 1,1 mm/min). Anche se il metodo utilizzato da Veres et al. per preparare la trachea per la visualizzazione era molto simile a quello utilizzato nei nostri studi, l’imaging con microscopia a due fotoni ha richiesto un set-up più elaborato e costoso rispetto al nostro metodo, che richiede solo un ambito di dissezione interfacciato con una telecamera CCD e illuminazione fluorescente.
Il nostro metodo per misurare l’MCC fornisce il tracciante tramite inalazione nasale di aerosol, aggiungendo pochissimo volume di liquido alle vie aeree (0,095 µl/5-min di aerosol), e la trachea rimane chiusa e intatta per le misure MCC. È importante notare che il tasso di MCC era quasi identico nei topi vivi o poco dopo l’eutanasia. Questo era piuttosto sorprendente come abbiamo ipotizzato eutanasia potrebbe causare stimolazione adrenergica (o rilascio di altri neurotrasmettitori) che potrebbe stimolare MCC30. L’assenza di escursione respiratoria in topi eutanasia facilita l’imaging delle particelle, e quindi misure MCC su un topo non vivente può essere tecnicamente più facile di eseguire tali misure su un animale che respira.
Non abbiamo trovato alcun effetto significativo della lunghezza dell’anestesia isoflurano (5 o 25 min) sul tasso di MCC. La maggior parte dei nostri studi sono stati condotti con topi anestetizzati con isoflurano, ma poiché l’accesso a un vaporizzatore dedicato potrebbe non essere sempre disponibile e la consegna simultanea di isoflurano e di un aerosol può essere difficile, abbiamo condotto una serie di studi utilizzando l’anestetico iniettabile, Avertin, che è ampiamente disponibile e non regolamentato dalla FDA, come molti anestetici iniettabili. Il tasso di MCC non era diverso tra i due anestetici. Anche se il numero di zattere di perline che abbiamo contato nei topi anestetizzati con Averetin era leggermente inferiore a quello del gruppo isoflurano, questa differenza non era significativa. Da notare, significativamente più perline aderito alle pareti tracheali nel gruppo isoflurano-anestetizzato e le zattere tallone nei topi Avertin erano significativamente più piccoli di quelli nei topi isoflurano. Ipotizziamo che queste differenze potrebbero essere dovute a differenze nella quantità di perline depositate nei polmoni dei due gruppi di topi, o nel loro modello di deposizione, soprattutto perché la frequenza respiratoria e i volumi tidal differiscono tra i topi che ricevono i due anestetici.
La durata dell’aerosolizzazione ha avuto un effetto significativo sul tasso di MCC, e abbiamo determinato che questo era dovuto alla massa di perline consegnate, con periodi di aerosolizzazione più brevi (5 min) dando maggiori tassi di MCC di aerosolizzazioni più lunghe (15 min). È improbabile che una differenza nella consegna del liquido spieghi i risultati perché i topi aerosolizzati con 1/3x perline per 15 min hanno ricevuto ~3 volte tanto liquido quanto i topi che hanno ricevuto 1x perline per 5 min, e i tassi di MCC di questi due trattamenti non differiscono. Da notare, ulteriore diluizione delle perle aerosol (1/4x per 5 min, Fig. 5B) non ha portato ad un ulteriore aumento del MCC. Così, se troppe perle sono aerosolizzati, sembrano sopraffare il processo di trasporto e molti non chiaro. Tuttavia, anche quando una massa ottimale di perline è stato aerosolizzato sulle vie aeree, alcune delle perle aderito alle pareti in molti dei preparati. Numerosi altri ricercatori hanno segnalato perline / particelle fallimento per cancellare nella trachea murina 8,16,29.
Al contrario, mentre le dimensioni e le forme delle zattere tallone erano variabili all’interno di un mouse e tra i topi, non abbiamo rilevato una differenza nel tasso di trasporto in funzione delle dimensioni zattera. Altri hanno anche notato che MCC era indipendente dalla dimensione e dalla forma delle particelle, ma è stato influenzato dalla proprietà del materiale delle particelle trasportate31,32.
Salina ipertonica è stato segnalato per aumentare il volume del liquido superficiale delle vie aeree da osmoticamente disegno liquido nelle vie aeree ed è stato usato clinicamente per ripristinare/accelerare MCC18,19. Mentre non abbiamo visto un effetto significativo del sale alto sul tasso di MCC, abbiamo notato che il tasso di MCC è stato mantenuto per il periodo di misurazione di 10 minuti nel gruppo di sale alto, mentre il tasso di MCC è diminuito dopo 5 minuti nel gruppo di controllo. Questi dati sono simili a quelli riportati da Donnelley et al.16, che hanno osservato che anche se il loro gruppo ad alto contenuto di sale non ha mostrato un tasso maggiore di MCC rispetto ai controlli trattati con soluzione salina isotonica, il tasso di MCC è stato mantenuto per periodi più lunghi nel gruppo ad alto contenuto di sale, suggerendo un aumento temporaneo dell’idratazione superficiale delle vie aeree. Da notare che gli studi di Donnelley et al. sono stati eseguiti in presenza di un bloccante del canale Na+ aggiunto al gruppo ad alto contenuto di sale. Poiché i nostri studi sono stati eseguiti senza l’aggiunta di un bloccante del canale Na+, questo supporta l’ipotesi che la soluzione salina ipertonica di per sé può ripristinare il leggero calo della MCC osservato dopo 5-min aerosolizzazione con soluzione salina isotonica. Non è chiaro perché meno zattere tallone sono stati contati nel gruppo alto sale, come non sembrava essere più particelle stazionarie né una differenza nella dimensione delle zattere rispetto al 5-min gruppo isotonico.
Come nucleotidi hanno dimostrato di aumentare MCC aumentando CBF, liquido superficiale delle vie aeree, e la secrezione di muco33, abbiamo studiato l’effetto di UTP quando incluso nel isotonico 5-min aerosol insieme con le perle tracker. Abbiamo trovato che un aerosol di 5 minuti di UTP ha aumentato significativamente il tasso di clearance delle perle, suggerendo che una dose di UTP sufficiente a modificare MCC è stata aerosolizzata alle superfici delle vie aeree. Sulla base di studi precedenti, è probabile che tutti e tre i componenti del sistema di clearance mucociliare (frequenza del battito ciliare, secrezione di mucina e idratazione della superficie delle vie aeree) siano stati stimolati dall’UTP per provocare un aumento complessivo della MCC. Così, la nostra tecnica sarà particolarmente utile per testare vari preparati farmacologici che possono influenzare MCC.
Infine, il nostro metodo di aerosolizzazione è stato utilizzato per misurare con successo MCC in 10 giorni-vecchio cuccioli di topo neonatale. Così questo metodo sarà utile per studiare MCC durante lo sviluppo o in modelli di malattia in cui alcune delle mutazioni che perturbano MCC sono stati trovati per provocare letalità neonatale11,28.
In sintesi, abbiamo sviluppato un semplice, poco costoso metodo per determinare MCC nei topi in vivo (vedi Tabella supplementare S1 per i parametri ottimali per le misure MCC come determinato in questo studio). Il nostro metodo utilizza aerosolizzazione e tracciamento trans-tracheale di perline fluorescenti per la determinazione MCC e ha una serie di vantaggi rispetto ad altri metodi MCC riportati in letteratura. In primo luogo, la trachea non deve essere aperto (o intubato) per l’introduzione del tracciante, e solo un volume molto piccolo di liquido viene inalato con le perle tracciante, riducendo la probabilità di perturbare il milieu del liquido superficie delle vie aeree. In secondo luogo, possiamo effettivamente visualizzare il comportamento delle perle durante la clearance, che può fornire ulteriori informazioni sui cambiamenti introdotti da un particolare intervento, cioè, modelli di migrazione, clumping, e / o deviazione da traiettorie uniformi, oltre a un tasso effettivo di MCC. In terzo luogo, abbiamo usato con successo questo metodo per studiare MCC in cuccioli di topo molto giovani. Inoltre, poiché questo metodo non è necessariamente terminale, può essere eseguito su topi vivi e può essere utilizzato per studiare MCC pre e post trattamento farmacologico. Inoltre, otteniamo tassi quasi identici di MCC su topi vivi o post-eutanasia. Infine, l’attrezzatura necessaria per questi studi è relativamente poco costoso e facilmente ottenibile e si spera che permetterà laboratori che studiano le perturbazioni nei componenti del sistema MCC per misurare effettivamente MCC in questi topi.