Campioni acquosi, cellule lisate o tessuti omogeneizzati sono mescolati con volumi uguali di una miscela fenolo:cloroformio. Questa miscela viene poi centrifugata. Poiché la miscela fenolo:cloroformio è immiscibile con l’acqua, la centrifuga provoca la formazione di due fasi distinte: una fase acquosa superiore e una fase organica inferiore. La fase acquosa sale verso l’alto perché è meno densa della fase organica che contiene il fenolo:cloroformio. Questa differenza di densità è il motivo per cui il fenolo, che ha solo una densità leggermente più alta dell’acqua, deve essere mescolato con il cloroformio per formare una miscela con una densità molto più alta dell’acqua.
I lipidi idrofobici si divideranno nella fase organica inferiore, e le proteine rimarranno nell’interfase tra le due fasi, mentre gli acidi nucleici (così come altri contaminanti come sali, zuccheri, ecc.) rimangono nella fase acquosa superiore. La fase acquosa superiore può quindi essere pipettata via. Bisogna fare attenzione ad evitare di pipettare qualsiasi fase organica o materiale all’interfaccia. Questa procedura viene spesso eseguita più volte per aumentare la purezza del DNA. Questa procedura produce un grande DNA a doppio filamento che può essere utilizzato in PCR o RFLP.
Se la miscela è acida, il DNA precipiterà nella fase organica mentre l’RNA rimane nella fase acquosa. Questo perché il DNA viene neutralizzato più facilmente dell’RNA.
Ci sono alcuni svantaggi di questa tecnica nell’uso forense. Richiede molto tempo e utilizza reagenti pericolosi. Inoltre, poiché si tratta di un processo in due fasi che comporta il trasferimento di reagenti tra le provette, il rischio di contaminazione è maggiore.