Macchio ha iniziato le lezioni di tip tap all’età di 3 anni ed è stato scoperto da un agente di talenti quando aveva 16 anni. Fu poi scritturato per il ruolo di Jeremy Andretti nella serie televisiva Eight is Enough. Dopo la fine di Eight is Enough, ottenne il ruolo di Johnny Cade nel film del 1983 The Outsiders. Fu questo ruolo che lo portò ad essere lanciato come Daniel LaRusso nel film del 1984, The Karate Kid e due dei suoi sequel, The Karate Kid Part II e The Karate Kid Part III. Macchio è apparso nel film del 1986 Crossroads, ritraendo lo studente di musica Eugene Martone. Sempre nel 1986, Macchio ha recitato in Cuba and His Teddy Bear a Broadway, accanto a Robert DeNiro. Nel 1992, ha recitato accanto a Joe Pesci e Marisa Tomei nella commedia di successo My Cousin Vinny, interpretando Billy Gambini, che è stato ingiustamente accusato di omicidio mentre passava in una piccola città dell’Alabama. Nel 1996, Macchio ha interpretato il ruolo principale di J. Pierrepont Finch nel revival del tour americano del musical vincitore del Tony Award 1962 How to Succeed in Business Without Really Trying, ricevendo recensioni positive. Riferendosi alla sua performance come corista in una produzione liceale dello stesso musical, Macchio ha detto: “Ero conosciuto come il ‘Dancing Kid’, non che fossi poi così bravo. Ma ballavo dall’età di tre anni, prendendo lezioni alla June Claire School of Dance a Babylon, Long Island.”
Nel 2005, Macchio ha interpretato se stesso nella serie HBO, Entourage. È apparso nel video musicale del 2007 per la canzone “Sweep the Leg” dei No More Kings come una caricatura di se stesso e Daniel di The Karate Kid. Nel 2008, è apparso in uno spot VitaminWater che ha caratterizzato il pilota NASCAR Carl Edwards. Macchio è stato raffigurato come “consigliere spirituale” di Edwards e vestito con i suoi abiti di Karate Kid. Da ottobre 2008, è apparso in diversi episodi della serie televisiva ABC Network Ugly Betty come Archie Rodriguez, un politico locale, con un ruolo semi-regolare come interesse amoroso di Hilda nello show. A partire dal novembre 2008, Macchio è stato classificato n. 80 tra VH1 100 Greatest Teen Stars.
Nel giugno 2010, Macchio è apparso nel corto online di Funny or Die, “Wax On, F*ck Off”, in cui i suoi cari mettono in scena un intervento per trasformare l’ex star dei bambini da un uomo di famiglia ben equilibrato in un tossicodipendente assediato da scandali tabloid, tutto al fine di aiutare la sua carriera. Durante il video Macchio reagisce alla vista di un poster per il remake di Karate Kid del 2010. Una battuta ricorrente nello sketch è che Macchio si confonde per un adolescente. Il corto è stato lodato da Bruce Fretts di TV Guide, che ha definito il video “sidesplitting” e “comic gold”. Il 20 settembre 2010, Macchio ha interpretato l’adulto Carl Morelli in una lettura in scena della commedia di Charles Messina A Room of My Own presentata dalla Bleecker Street Theater Company. Nel febbraio 2011 è stato annunciato che avrebbe partecipato a Ballando con le stelle della ABC. È stato eliminato durante le semifinali, piazzandosi quarto nella competizione generale. Macchio è apparso nei video musicali della band canadese Danko Jones per “Had Enough” e “I Think Bad Thoughts”, con Elijah Wood e Jena Malone.
Nell’aprile 2012, Macchio ha partecipato al film Hitchcock, basato sul libro non-fiction Alfred Hitchcock and the Making of Psycho, con Anthony Hopkins, Helen Mirren, Scarlett Johansson, Jessica Biel e Toni Collette, e diretto da Sacha Gervasi. Macchio ritrae lo sceneggiatore di Psycho Joseph Stefano. Nel 2013, è apparso in How I Met Your Mother. Il protagonista, Barney Stinson, afferma che il personaggio di Macchio, Daniel LaRusso, in The Karate Kid non è il vero karate kid; invece, è Johnny Lawrence, la nemesi di Daniel nel film. Nell’episodio dell’ottava stagione “The Bro Mitzvah”, Macchio viene invitato all’addio al celibato di Barney, anche se Barney è deluso dalla sorpresa, aspettandosi l’attore William Zabka, il “vero Karate Kid”. Per tutta la durata dell’episodio, i personaggi notano le somiglianze tra Barney e Macchio, con il disgusto di Barney. Alla fine della serata, il clown ingaggiato per l’intrattenimento della festa si rivela essere Zabka. Da febbraio a marzo 2016, Macchio è stato co-protagonista con Mario Cantone nella produzione Off-Broadway A Room of My Own, dopo aver letto la commedia nel 2010 e nel 2014.
Macchio sta attualmente riprendendo il suo ruolo di Daniel LaRusso in Cobra Kai, una serie action comedy-drama Netflix presentata in un formato di narrazione episodica, iniziata nel 2018. È anche un produttore co-esecutivo della serie, insieme a William Zabka. La serie è ambientata 34 anni dopo gli eventi del torneo di Karate All Valley del 1984 e ruota intorno a un Johnny Lawrence (Zabka), un down-and-out che – cercando di rimettere in sesto la sua vita e ottenere la redenzione per la sua sconfitta nel torneo del 1984 – riapre il dojo Cobra Kai. Questo riaccende la sua rivalità con un LaRusso ormai affermato, che sta lottando per mantenere l’equilibrio nella sua vita senza la guida del suo mentore ormai scomparso, il signor Miyagi.