Alpha-synuclein is a DNA binding protein that modulates DNA repair with implications for Lewy body disorders

Humans

Humaan weefsel werd verkregen via het Oregon Alzheimer’s Disease Center (ADC) en OHSU Department of Pathology en de betrokken proefpersonen hadden vastgestelde klinische en pathologische diagnoses (Dementia with Lewy Bodies). Het gebruik van weefsel werd goedgekeurd door de IRB van OHSU en uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers en/of hun wettelijke vertegenwoordigers.

Dieren

Dieren werden gehuisvest door OHSU’s Department of Comparative Medicine in een licht-donkercyclus en temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerd vivarium en onderhouden met een ad libitum voedsel- en waterdieet. Alle experimenten werden goedgekeurd door de IACUC van OHSU, alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften, en alles werd in het werk gesteld om het aantal gebruikte dieren en hun lijden tot een minimum te beperken.

Muismodel generatie

Transgene muislijnen

Met behulp van de OHSU Transgenic Mouse Model Core, creëerden we een muis die humaan alfa-synucleïne uitdrukt, gefuseerd met versterkt GFP (C-terminal tag) met een puntmutatie bij Alanine 53 (GCA > ACA) waardoor een threonine aminozuurverandering optreedt (A53T Syn-GFP). De A53T-Syn-GFP-sequentie werd gekloond in de MoPrp.Xho vector (gift van David Borchelt)74 op de XhoI site. Expressie is onder transcriptionele controle van de muis prioneiwit promotor. De 30 bp linker sequentie tussen A53T Syn en GFP is GGTACCGCGGGCCCGGATCCATCGCCACC, wat zich vertaalt in GlyThrAlaGlyProGlySerIleAlaThr. Deze muizenlijn vertoont A53T Syn-GFP expressie in >90% van de corticale neuronen en <10% van de astrocyten (A.J.S. en V.K.U., ongepubliceerde gegevens). 142E Syn-GFP transgene muizen32,33,39,75 en 142E Syn-GFP / muis mSynKO muis lijnen werden verkregen van de makers van de lijn, Edward Rockenstein en Eliezer Masliah. Nucleair gelokaliseerde TdTomato-NLS transgene muizen werden verkregen van de Jackson Laboratories (stock # 023035). Alpha-synucleïne knock-out dieren en geschikte controle muizen werden verkregen uit Jackson Laboratories (stock # 016123, 005304).

AAV8 virus generatie

We creëerden virale constructen van A53T Syn-GFP met puntmutaties in alfa-synucleïne op serine-129 waardoor ofwel een alanine (TCT > GCT) of asparaginezuur (TCT > GAT) aminozuur verandering (constructen gift van Pamela McLean). Deze constructen werden gekloond in de zelf-complementaire AAV8 virale vector pTRS-KS/CBh-GFP (uit de National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, IN), onder transcriptionele controle van de CBh (Chicken Beta Actin Short) promotor, met behulp van de restrictie-enzym sites AgeI en ApaI. De 30 bp linker-sequentie tussen alpha-Syn & enhanced GFP is GGTACCGCGGCCCGGGATCCATCGCCACC. De uiteindelijke scAAV8-CBh-A53T-S129A-Syn-GFP en scAAV8-CBh-A53T-S129D-Syn-GFP virussen werden gemaakt door de Gene Transfer Vector Core bij Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Boston, MA.

Intraventriculaire AAV8 virale injecties

ICV in P0 neonaten werden gedaan volgens de vrije hand protocol76. We geïnjecteerd 2 µL van onverdund virus in elke laterale ventrikel bij titers ~ 1E12 genomic kopieën per milliliter. De enige afwijking van deze gepubliceerde protocol is dat we niet verdund virus in trypan blue.

Muis Lewy pathologie inductie

2 tot 3 maanden oude mannelijke muizen werden geïnjecteerd met muis WT-sequentie PFF’s volgens onze eerder gepubliceerde protocollen 25. 2,5 ul (2 mg / ml) vers gesoniculeerde PFF’s of 2,5 ul PBS werd geïnjecteerd in de rechter hemisfeer primair sensomotorische cortex in isofluraan (1% tot 2%) -verdoofde dieren en teruggebracht naar hun huis kooi. Ze werden opgeofferd en voorbereid voor IHC zoals hieronder beschreven na post-injectie interval van 3-6 maanden (6-9 maanden oud).

Muis hersenen in vivo beeldvorming & analyse

Craniale venster chirurgie en beeldvorming werd gedaan met behulp van hetzelfde protocol als we eerder hebben gepubliceerd25,39 in isofluraan verdoofde dieren, met behulp van een Zeiss LSM 7MP multiphoton microscoop uitgerust met dual channel BiG (binaire GaAsP) detectoren en een Coherent Technologies Chameleon titanium-saffier femtoseconde gepulseerde laserbron (afgestemd op 860 nm voor beeldvorming Syn-GFP). Zeiss Zen 2011 beeldacquisitie software werd gebruikt. Voor nucleaire laser-geïnduceerde schade (LID) experimenten, werd de Bleken functie in Zen gebruikt om kleine, submicron-sized regio’s verlichten binnen de kern met Chameleon laser afgestemd op ~ 730 nm voor <1 ms). Er is een ~ 4 sec vertraging nodig om de laser te schakelen naar en van de LID (~ 730 nm) golflengte. In een subset van experimenten, werden dieren gegenereerd die Syn-GFP uitgedrukt gelijktijdig met nucleaire gelokaliseerde TdTomato-NLS. Deze toonden aan dat het lokaliseren van de LID puls naar regio’s >2 pm van de periferie van de cel werden altijd gepositioneerd binnen de kern. Dit criterium werd gebruikt om de LID puls lokaliseren binnen kernen van Syn-GFP uitdrukken corticale neuronen in vivo. LID beelden werden geanalyseerd met ImageJ vergelijkbaar met onze eerder beschreven FRAP experimenten 25,39. Regio’s van belang (ROI’s) werden geselecteerd om de gemiddelde fluorescentie waarden in LID en controle ROI’s binnen de kern te verkrijgen. De verhouding van het signaal op elk tijdstip van de LID versus de controle ROI’s werd gebruikt om de Verrijking Ratio te berekenen. Voor FRAP experimenten na LID, een soortgelijke fotobleaching en analyse protocol werd gebruikt als onze eerder gepubliceerde werk 25,39. Gegevens werden geanalyseerd in Prism 6 (GraphPad) om enkele exponentiële past op het herstel tijdsverloop en de immobiele en mobiele fracties te verkrijgen. Alle gebruikte dieren waren 5 tot 9 maanden oud.

Muis corticale neuron culturen en beeldvorming

C57/BL6 muizen werden gebruikt om primaire neuronale culturen geïsoleerd van embryonale muizen, gebaseerd op de methoden van Kaech en Banker77, en aangepast van Gray en collega’s78 te genereren. Kort gezegd, werden embryo’s geoogst op 18 dagen van de dracht van verdoofde vrouwtjes. Cortex werd ontleed, voorzichtig fijngehakt, en getrypsiniseerd om suspensies van verspreide neuronen te genereren. Vers geïsoleerde corticale neuronen werden geëlektroporeerd met plasmiden coderend voor twee menselijke alfa-synucleïne constructen gelabeld met een versterkte GFP (scAAV-huSyn_s129A:EGFP, scAAV-hySyn_s129D:EGFP). 330,000 geëlektroporeerde corticale neuronen van elk construct werden uitgezet op schalen met poly-L-lysine-gecoate dekglaasjes in MEM medium (GIBCO / Life Technologies), 5% FBS (Atlanta Biologicals), en 0,6% glucose (Sigma-Aldrich). Na 4 uur, werd het medium verwijderd en vervangen door Neurobasal Medium aangevuld met 1 × GlutaMAX (GIBCO / Life Technologies) en 1 × GS21 (MTI-GlobalStem). Elke schotel werd gevoed met elke week 0,5 ml Neurobasal media plus GlutaMAX en GS21, met de eerste voeding (op 5 dagen in vitro (DIV)) met AraC. Na 7 DIV, werden dekglaasjes van gekweekte neuronen van elk construct afgebeeld met behulp van een live cell systeem met een gesloten beeldvorming kamer. Celcultuur nucleaire LID experimenten werden uitgevoerd op dezelfde imaging platform met dezelfde protocollen voor beeldvorming en analyse als onze in vivo nucleaire LID experimenten hierboven beschreven.

Muis hippocampus culturen & PFF zaaien

Muis hippocampus culturen en PFF zaaien geïnduceerde Lewy pathologie vorming werd uitgevoerd met behulp van onze eerder beschreven technieken79,80. Kortom, werden primaire neuronale culturen bereid uit E16-E18 CD1 muizenhersenen (Charles River). Alle procedures werden uitgevoerd volgens de NIH Guide for the Care and Use of Experimental Animals en werden goedgekeurd door de Universiteit van Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee. Gedissocieerd hippocampale neuronen werden uitgezet op poly-D-lysine gecoate dekglaasjes (Carolina Biological Supply) bij een dichtheid van ~ 50.000 cellen / cm 2. Recombinant humaan alfa-synucleïne PFF’s met de pathogene S87N mutatie81 werden verdund in PBS op 0,1 mg / ml, sonisch, en verdund in neuronale media. Neuronen werden behandeld met 5 ug / ml bij DIV 7 en geïncubeerd gedurende 12 dagen. Cellen werden gefixeerd in 4% PFA/4% sucrose gedurende 15 min bij kamertemperatuur en vervolgens permeabilized in 0,3% Tx-100 en geblokkeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in 3% FBS/3% BSA. Primaire antilichamen (anti-α-Synuclein PhosphoSer129 kloon 81 A, 1:2000 verdunning, Biolegend cat # 825701; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) kloon JBW301, 1:500 verdunning, Millipore cat # 05-636) werden verdund in de blokkerende buffer en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. De dekglaasjes werden vervolgens 3 keer gewassen met PBS en geïncubeerd met de passende Alexa-fluor gelabelde secundaire antilichamen. Gewassen dekglaasjes werden op objectglaasjes gemonteerd met Fluoromount-G met DAPI (Fisher Scientific).

Tweede antilichamen: Alexa 488, geit anti muis IgG2a, 1:1000 verdunning, Fisher Scientific; Alexa 594, geit anti muis IgG1, 1:1000 verdunning, Fisher Scientific.

Een PE lamina Scanner werd gebruikt om de dekglaasjes af te beelden. HALO-software (Indica Labs) werd gebruikt om γH2AX foci en DAPI-gekleurde kernen te tellen op 1,5 mm van de rand van elk dekglaasje. Statistische analyse van de gegevens werd uitgevoerd met Graphpad Prism versie 4.

Immunofluorescentie & analyse

HAP1 cellen

Hap1 ouderlijke WT controle (item #C631 batch 29663) en Hap1 Human SNCA 103 bp deletie knockout (item #HZGHC003210c003 batch 2) cellijnen werden verkregen van Horizon Discovery en gekweekt in IMDM media (Gibco# 11995-065) + 10% foetaal runderserum + Pen-Strep en gekweekt in een gehumidificeerde incubator bij 37 C met 5% CO2. Cellen werden gezaaid op PLL gecoate # 1,5 dekglaasjes in 35 mm schalen een dag voor de fixatie en gekweekt tot ~ 80% confluentie. Cellen werden gefixeerd in 4% PFA in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT), 1x gewassen in PBS en bewaard bij 4 C in PBS tot kleuring procedure. Vaste cellen werden permeabilized met 1 mL PBS + 0,25% Triton-X 100 voorzichtig schudden bij RT gedurende 20 minuten. De oplossing werd verwijderd en de cellen werden gedurende 20 minuten geblokkeerd in 1 ml blokkeerbuffer (0,1% Triton-X 100 10% normaal geitenserum in PBS). Primaire antilichamen werden verdund in incubatiebuffer (1:5 verdunning van blokkeringsbuffer in PBS) en ’s nachts geïncubeerd bij kamertemperatuur onder zacht schudden. De volgende dag werden de cellen 3x gewassen in PBS gedurende 15 minuten. Complementaire fluorescent gemerkte secundaire antilichamen werden 1:1000 verdund in incubatiebuffer, aan de cellen toegevoegd en ’s nachts bij kamertemperatuur in het donker onder zacht schudden geïncubeerd. De volgende dag werden de cellen 3x gewassen in PBS gedurende 20 minuten. Nucleaire kleuring werd gedaan net voor de laatste PBS wassen met 2,5ug/mL DAPI (Sigma D9542) in PBS gedurende 20 minuten. Voor de montage werden de cellen kort gewassen in gedeïoniseerd H 2 O. Coverslips werden gemonteerd met 13 µL CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution en verzegeld met Biotium CoverGrip Coverslip Sealant. Glaasjes werden afgebeeld op een Zeiss Elyra PS.1 710 laser-scanning confocale microscoop met Zen-software. Z-stacks van 0,5 µm stappen werden verkregen bij 63x zoom1, met zorg om nooit verzadigen antilichaam signaal binnen de kern.

Primaire gebruikte antilichamen waren: anti-Syn1, 1:500 verdunning, muis monoklonale, BD Biosciences, cat. 610786; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer clone 10 H, 1:500 verdunning, kip polyklonaal, Tulip BioLabs, cat. 1023; anti-Fosfo-Histon H2A.X, 1:500 verdunning, konijn-monoklonaal, Cell Signaling, cat. 9718; anti-fosfoS129-Syn EP1536Y, 1:500 verdunning, konijn-monoklonaal, Abcam, ab51253; anti-fosfoS129-Syn 81 A, 1:667 verdunning, muis-monoklonaal, Covance, cat. 825701; anti-Syn 4B12, 1:500 verdunning, muismonoklonaal, Biolegend, cat. 807804; en anti-Syn EPR20535, 1:100 verdunning, konijnmonoklonaal, Abcam, ab212184. De gebruikte secundaire antilichamen waren: Alexa Fluor 647 geit anti-rabbit, ThermoFisher cat.A-21245; Alexa Fluor 555 geit anti-muis, Abcam ab150114; Alexa Fluor 488 ezel anti-kip, Jackson ImmunoResearch cat.703-545-155.

Bleomycine behandeling ICC: Bleomycinesulfaat (Selleckchem, cat. S1214) poeder werd verdund in H2O om een 10 mg/ml stockoplossing te maken, aliquoteerd en bewaard bij -80C. Een dag voor de behandeling Hap1 WT en Hap1 SNCA KO cellen werden gezaaid op PLL gecoate 1,5 dekglaasjes in 35 mm schotels tot ~ 80% confluent de volgende dag te zijn. De dag van de behandeling, werd normale media verwijderd en 2 ml verse warme media met 10ug/mL Bleomycine werd toegevoegd aan elk gerecht. Sham cellen hadden verse warme media, zonder Bleomycin, toegevoegd aan elk gerecht. De cellen werden gedurende 1 uur in een vochtige incubator geplaatst bij 37 C met 5% CO2. Na de behandeling werden de media verwijderd en de cellen werden gefixeerd in 4% PFA in PBS gedurende 10 minuten bij RT, 1x gewassen in PBS en bewaard bij 4 C in PBS tot de kleuring procedure.

Bleomycine behandeling Western Blot: Een dag voor de behandeling Hap1 WT en Hap1 SNCA KO cellen werden gezaaid op 2 × 10 cm platen per conditie tot ~ 80% confluent de volgende dag. Bleomycine behandeling werd gedaan hetzelfde als voor ICC. Na behandeling werd de media verwijderd en cellen werden 1x gewassen met warme PBS. Cellen werden geoogst door trypsinisatie en verzameld in 15 mL conische buizen gepelleteerd voor 5 min 200rcf. Vloeistof werd afgezogen, pellets werden geresuspendeerd in 2 mL PBS en overgebracht naar 2 × 2 mL microcentrifugeerbuisjes. Eiwitten werden geëxtraheerd in cytosolische en nucleaire fracties met behulp van de NE-PER extractie kit (Thermo-Fisher, cat. 78833) volgens de aanbevelingen van de fabrikant met de toevoeging van een korte sonificatie (10 seconden, 10 kHz) na de eerste nucleaire resuspensie stap. Eiwit preps werden opgeslagen bij -80C tot Western blot analyse.

Voor confocale beeldvorming, werden beelden verkregen op een Zeiss Elyra PS.1 confocale microscoop met een Plan-Apochromat 63x/1.40 olie objectief. Alle colokalisatie analyse werd gedaan met behulp van ImageJ (NIH) software door ROI’s voor elke kern van een enkel beeld gelegen in het midden van de kern in de z-richting te creëren. De CoLoc 2 plugin werd gebruikt om de Pearson’s coëfficiënt tussen signalen en de verwachte achtergrondwaarde na willekeurige vertaling van een kanaal ten opzichte van de andere te meten.

Muis hersenen

Mannetjes hersenen (leeftijd 3-6 maanden oud) werden ontleed onmiddellijk post mortem, geplaatst in 6 mL verse 4% PFA in PBS, en gefixeerd met een Pelco Biowave Pro gedurende 90 minuten bij 150 W in een circulerende waterbad. De hersenen werden verplaatst naar 4 ° C te blijven ’s nachts vast te stellen. De volgende dag werd de PFA vervangen door 0,05% natriumazide en bewaard bij 4 ° C tot verdere verwerking.

Na fixatie werden de hersenen gesneden in 50 µm coronale of sagittale drijvende secties met behulp van een Vibratome Leica VT1000S. Voor bepaalde antilichamen was warmte-geïnduceerde epitoop retrieval (HIER) vereist vóór het blokkeren. Het hersenplakje werd toegevoegd aan een buisje met HIER-buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris Base, 0,05% Tween, pH = 8.5), gedurende 20 min. gestoomd en gedurende 20 min. bij kamertemperatuur afgekoeld. Weefsel werd gedurende 1 uur geblokkeerd in de blokkeerbuffer (0,1% Triton-X, 10% geitenserum, in PBS). Primair antilichaam werd verdund in incubatiebuffer (1:5 verdunning van blokkeerbuffer) in een concentratie geoptimaliseerd voor elk antilichaam en ’s nachts geïncubeerd, in het donker, terwijl geschud bij kamertemperatuur. Het weefsel werd gedurende 30 min. 5 maal gewassen met PBS. Het complementaire secundaire antilichaam werd verdund in incubatiebuffer en eveneens overnacht geïncubeerd bij kamertemperatuur. De volgende dag werd het weefsel gewassen met 5 wisselingen PBS. DAPI-kleuring werd uitgevoerd net voor de laatste wasbeurt. Het weefsel werd gemonteerd op een dia in CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution. Een 1,5 dekglaasje werd verzegeld over het weefsel met Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

De gebruikte primaire antilichamen waren: anti-α-Synucleïne fosfo (Ser129) antilichaam kloon 81 A, muis monoklonaal, 1:667 verdunning, Biolegend cat#825701; Anti-alpha Synucleïne (fosfo S129) antilichaam , konijn monoklonaal, 1:500 verdunning, Abcam cat#ab51253; Anti-asyn (Syn1/mSyn), muis monoklonaal, 1:500 verdunning, BD Biosciences cat#610786; Anti-pan-ADP-ribose bindingsreagens, konijn, 1:1000 verdunning, Millipore cat#MABE1016; anti-Poly(ADP-Ribose) Polymer, clone 10 H (PADPR), kip, 1:100 verdunning, Tulip BioLabs cat#1023; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antilichaam kloon JBW301, muis, 1:500 verdunning, Millipore cat#05-636; Anti-fosfo-Histon H2A.X (Ser139) Antilichaam kloon 20E3, konijn monoklonaal, 1:500 verdunning, Cell Signaling cat#9718 Gebruikte secundaire antilichamen waren: Alexa 647, geit anti-rabbit, 1:1000 verdunning, Invitrogen cat#MPA21245; Alexa 647, geit anti-muis, 1:1000 verdunning, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 555, geit anti-rabbit, 1:1000 verdunning, Abcam cat#ab150078; Alexa 555, geit anti-muis, 1:1000 verdunning, Abcam cat#ab150114; Alexa 488, geit anti-kip, 1:1000 verdunning, Abcam cat# ab150169.

Voor confocale beeldvorming werden beelden verkregen op een Zeiss Elyra PS.1 confocale microscoop met een Plan-Apochromat 63x/1.40 olie objectief. Laser bevoegdheden van 1-5% werden gebruikt om z-stacks te verwerven door 2-4 regio’s van cortex per weefsel sectie. Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) imaging software werd gebruikt om de IHC gegevens te analyseren. Om te segmenteren uit de kern van het cytoplasma, werd een oppervlak gemaakt met behulp van de DAPI-kanaal. Alleen hele neuronale kernen werden geanalyseerd. Statistische informatie (gemiddelde intensiteit, som intensiteit, totaal aantal vlakken) voor elk kanaal werd geëxporteerd en verder geanalyseerd in Prism 6 (GraphPad). Voor de analyse van foci binnen de kernen, werd de kern signaal van het kanaal van keuze gemaskeerd met behulp van een nucleaire oppervlak gemaakt van de DAPI-kanaal. Van de nucleaire signaal van de gewenste gemaskeerd kanaal, werden oppervlakken gemaakt om nucleaire foci kwantificeren.

Human hersenen

Secties uit de amygdala van de menselijke Dementie met Lewy Body autopsie gevallen werden onmiddellijk bij autopsie (postmortale interval 12-48 uur), geplaatst in 6 ml verse 4% PFA in PBS, en gefixeerd met een Pelco Biowave Pro gedurende 90 minuten bij 150 W in een circulerende waterbad. De secties werden verplaatst naar 4 ° C te blijven ’s nachts te fixeren. De volgende dag werd de PFA vervangen door 0,05% natriumazide en bewaard bij 4 ° C tot verdere verwerking.

Na fixatie, werden amygdala secties gesneden in 50 µm drijvende secties met behulp van een Vibratome Leica VT1000S. Het weefsel werd gedurende 1 uur geblokkeerd in de blokkeerbuffer (0,1% Triton-X, 10% geitenserum, in PBS). Primair antilichaam werd verdund in incubatiebuffer (1:5 verdunning van blokkeerbuffer) in een concentratie geoptimaliseerd voor elk antilichaam (zie hieronder) en ’s nachts geïncubeerd, in het donker, onder schudden bij kamertemperatuur. Het weefsel werd gedurende 60 min. 5 maal gewassen met PBS. Het complementaire secundaire antilichaam werd verdund in incubatiebuffer en eveneens overnacht geïncubeerd bij kamertemperatuur. De volgende dag werd het weefsel gewassen met 5 wisselingen PBS. DAPI-kleuring werd uitgevoerd net voor de laatste wasbeurt. Het weefsel werd gemonteerd op een dia in CitiFluor CFMR2 Antifadent Solution. Een 1,5 dekglaasje werd verzegeld over het weefsel met Biotium CoverGrip Coverslip Sealant.

Gebruikte primaire antilichamen waren: anti-α-Synuclein Phospho (Ser129) Antibody kloon 81 A, muis monoklonaal, 1:667 verdunning, Biolegend cat#825701; Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody kloon 20E3, konijn monoklonaal, 1:500 verdunning, Cell Signaling cat#9718. Gebruikte secundaire antilichamen waren: Alexa 647, geit anti-muis, 1:1000 verdunning, Invitrogen cat#MPA21236; Alexa 488, geit anti-rabbit, 1:1000 verdunning, Abcam cat#ab150077.

Images werden vastgelegd op een Zeiss LSM 880 met Airyscan microscoop. Om de specifieke antilichaam signalen van de verhoogde autofluorescerende achtergrond kleuring binnen het menselijk weefsel monsters te bepalen, werd een lineaire unmixing protocol gebruikt. De lambda-modus werd gebruikt om de parameters voor het objectief, de lasers en de dichroics in te stellen zoals vereist voor het afbeelden van het veelkleurige monster. Met dezelfde parameters werden individuele referentiespectra gemaakt van enkelkleurige gekleurde monsters. Bovendien werd een niet-gekleurd monster gebruikt om de achtergrondreferentiespectra te bepalen. Alle residuen werden geminimaliseerd bij het creëren van referentiespectra. De multicolor monster werd vervolgens belicht, met vermelding van de relevante achtergrond en single-color spectra, en ongemengd met behulp van Zeiss Zen software.

Imaris (Bitplane, Oxford Instruments) imaging software werd gebruikt om IHC gegevens te analyseren. Om te segmenteren uit de kern van het cytoplasma, werd een oppervlak gemaakt met behulp van de DAPI-kanaal. Alleen hele neuronale kernen werden geanalyseerd. Statistische informatie (gemiddelde intensiteit, som intensiteit, totaal aantal vlakken) voor elk kanaal werd geëxporteerd en verder geanalyseerd in Prism 6 (GraphPad). Voor de analyse van foci binnen de kernen, werd de kern signaal van het kanaal van keuze gemaskeerd met behulp van een nucleaire oppervlak gemaakt van de DAPI-kanaal. Van het nucleaire signaal van het gewenste gemaskeerde kanaal werden oppervlakken gemaakt om de nucleaire foci te kwantificeren.

HAP1 cel comet assay

HAP1 cel neutrale comet-assays werden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van Trevigen (Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K). Celsuspensies (2 × 104 cellen/ml) in serumvrij IMDM (Sigma), gemengd in een verhouding 1:2 met Comet LMAgarose (Trevigen), werden op CometSlidesTM (Trevigen) gepipetteerd en bij 4 °C gedurende 10-15 min te gieten gelegd. De glaasjes werden een nacht in het donker in de lysisoplossing (Trevigen) bij 4 °C geïncubeerd en vervolgens gedurende 1 uur in het donker in de neutrale elektroforesebuffer (300 mM natriumacetaat, 100 mM Tris-HCl, pH 9) bij 4 °C. De objectglaasjes werden gedurende 40 min. bij 20 V (1 V/cm) bij 4 °C in verse buffer geëlektroforeerd. Na de elektroforese werden de objectglaasjes eerst geïncubeerd in DNA-precipitatiebuffer (1 M ammoniumacetaat, 86,6% EtOH), en vervolgens 70% EtOH bij kamertemperatuur in het donker, telkens gedurende 30 min, en gedroogd bij 37 C. De objectglaasjes werden gekleurd met 1X SYBRTMgreen (Invirogen) in 1X PBS (Gibco) bij kamertemperatuur gedurende 30 min in het donker, 10 maal ondergedompeld in dH 2 O om overtollige kleuring uit te spoelen, en gedroogd bij 37 °C. Comets werden gevisualiseerd op een Zeiss Apotome met behulp van een 10X lens en gescoord met CometScoreTM.

Bleomycine behandeling Comet Assay: Een dag voor de behandeling Hap1 WT en Hap1 SNCA KO cellen werden gezaaid op 2 × 35 mm platen per conditie tot ~ 80% confluent de volgende dag zijn. Bleomycine en Sham behandeling protocollen werden gedaan hetzelfde als voor ICC. Na de behandeling werd de media verwijderd en de cellen werden gewassen 1x met warme PBS. Als een herstelperiode volgde, dan verse warme media werd toegevoegd en cellen werden teruggeplaatst in de incubator. Cellen werden geoogst door trypsinisatie met 0,05% Tripsin-EDTA (Gibco cat. 15400-54). Getrypsiniseerde cellen van 2 × 35 mm platen werden verzameld in 15 ml conische buizen en gepelletiseerd gedurende 5 min 200rcf. Vloeistof werd afgezogen, pellets werden geresuspendeerd in 250uL verse media zonder FBS of Penn-Strep, overgebracht naar een 2 mL microcentrifugeerbuis en bewaard op ijs tot gebruik in de Comet Assay zoals hierboven beschreven.

Hersenweefsel van muizen comet assay

Vers geëxtraheerd hersenweefsel van mannelijke muizen (leeftijd 1, 3, 6-9 maanden oud) werd fijngehakt met een scheermesje en gesuspendeerd in ijskoud PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) en gehomogeniseerd gedurende 30 seconden met een hand-held homogenisator. Het weefsel werd gedurende één minuut microgecentrifugeerd en het supernatant werd verdund in een verhouding 1:10 in PBS. De cellen werden geteld met een hemocytometer en verdund tot 1 × 105/ml. De verdunde cellen werden gecombineerd met LM-agarose in een verhouding van 1:2 (v/v) en verdeeld over de putjes van het glazen comet-glaasje (Trevigen comet assay kit, cat#4250-050-K). De glaasjes werden gedurende 15 minuten in het donker gedroogd bij 4 °C en vervolgens bij 4 °C gedurende een nacht in de lysisoplossing van de kit geplaatst. Overtollige buffer werd van de objectglaasjes afgevoerd vóór onderdompeling in 50 ml TBE, pH 7,4, gedurende 30 minuten bij 4 °C. De glaasjes ondergingen elektroforese in TBE, pH 7,4, bij 20 V gedurende 40 minuten bij 4 °C. Overtollig TBE werd afgetapt en de objectglaasjes werden tweemaal gedurende 5 minuten in dH2O geplaatst. De objectglaasjes werden vervolgens gedurende 5 min. in 70% EtOH geplaatst en gedurende 15 min. bij 37 °C gedroogd. 100 µl 1X SYBR-Green werd op elke cirkel van gedroogde agarose gepipetteerd en de monsters werden gedurende 30 min. bij kamertemperatuur in het donker gekleurd. Overtollige SYBR-Green-oplossing werd verwijderd en de glaasjes werden verschillende keren gespoeld in dH 2 O. De glaasjes mochten volledig drogen bij 37 °C en werden bewaard bij 4 °C. Comets werden gevisualiseerd op een Zeiss ApoTome microscoop onder een 10X objectief en gescoord met CometScore ™ software (TriTek).

Electroforetic mobility shift assay

DNA voorbereiding

300 bp fragmenten werden geëxtraheerd uit een 100 bp ladder (NEB) gescheiden op een 1% agarose gel bij 175 V gedurende 2 uur bij RT met behulp van de QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Het DNA werd gereinigd met de DNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research), en geëlueerd in 1X TE. Eindconcentratie en DNA-zuiverheid werden bepaald door Nanodrop.

Electroforetic mobility shift assay

DNA-fragmenten (20 ng) werden gemengd met recombinant hu_ser129_phospho-syn (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg, en 16 µg; Proteos, Inc.), recombinant hu_α-synucleïne (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg en 16 µg; Proteos, Inc.) of recombinant glutathion S-transferase (250 ng, 1 µg, 4 µg, 8 µg en 16 µg; GenScript) in een reactie van 20 μL met 94 mM Tris-Cl, pH 8.0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, en 5% ficoll op ijs gedurende 20 min, daarna kamertemperatuur gedurende 30 min. Na toevoeging van 2 µL 10X Orange Loading Buffer (Licor), werden 8 μL van de totale reactie geladen in een 10% of 6% polyacrylamide TBE gel (Novex) en uitgevoerd bij 100 V gedurende 2 uur bij RT. De gels werden gedurende 30 minuten gekleurd met 10X SYBRTM Safe DNA Stain (Invitrogen) in 1X TBE. Beelden werden verkregen met het Fluorchem M imaging systeem en gekwantificeerd met ImageJ Gel Analyzing tool.

Western blot

10% polyacrylamide TBE gels werden overgebracht op een Biodyne™ B Nylon Membraan (Thermofisher Scientific) bij 30 V gedurende 1 uur en 16 min. op ijs in 0.5X TBE met behulp van het Novex XCell II Blotting System (Invitrogen). De membranen werden ’s nachts geblokkeerd in Odyssey PBS Blocking Buffer (Li-Cor) en gedurende 1 uur bij RT gekleurd met Syn1 (1:1,000; Biolegend) en ’s nachts bij 4 °C met IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG (1:10,000; Li-Cor). Beelden werden verkregen met behulp van Li-Cor Odyssey CLx Imaging System.

Western Blot voor Hap1 Nucleair eiwit preps: Concentraties van de Hap1 NE-PER cytoplasmatische en nucleaire eiwit preps werden gekwantificeerd met behulp van de Pierce BCA Eiwit Assay kit (Pierce, cat. 23225) en gelezen op een Multiskan FC Microplate Photometer (Fisher, cat. 51119000) met een 550 nm uitlezing. 5 µg & 10 µg kerneiwit werd verdund in SDS-monsterbuffer (Novex, cat. LC2676) + BME (Gibco, cat. 21985-023) en geladen op een 10-20% Tris-Glycine gel (Novex, cat. XP10202BOX). 3 µL vooraf gekleurde eiwitladder (NEB, cat. P7719) werd ter referentie geladen. De gel werd met behulp van het Novex Xcell Blotting System in SDS running buffer (Novex, cat. LC2675) gedurende 70 min. bij 120 V. gedesintegreerd en klaargemaakt voor transfer op een Immobilon-FL PVDF membraan (Millipore, cat. IPF00010). De gel werd overgebracht in Tris-Glycine transferbuffer (Novex, cat. LC3675) op ijs gedurende 2 uur bij 25 V. Na het overbrengen werd het membraan verwijderd en onmiddellijk gefixeerd in 4% PFA + 0,01% glutaaraldehyde gedurende 10 minuten onder zacht schudden bij RT. Het membraan werd 1x gewassen in milliQ H2O en gekleurd met de REVERT total protein stain kit (LI-COR, cat. 926-11010) volgens het protocol van de fabrikant. Totaal gekleurd eiwit werd verkregen met de LI-COR Odyssey CLx Imager. Na omkering van de REVERT-kleuring werd het membraan 1x gewassen in milliQ H2O en geblokkeerd in Odyssey Blocking Buffer (LI-COR, cat. 927-40000) gedurende een nacht bij 4 C onder zacht schudden. Primaire antilichamen werden verdund 1:1000 in de blokkeerbuffer en geïncubeerd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Het membraan werd 3x gewassen in 0.1% Tween20 in PBS gedurende 10 min. Secundaire antilichamen (LI-COR IR680LT ezel anti-rabbit cat. 926-68023; IR800CW ezel-antimuis cat. 926-32212) werden verdund 1:10000 in blockingbuffer en gedurende 1 uur geïncubeerd bij RT onder zachtjes schudden. Het membraan werd 3x gewassen in 0.1% Tween20 in PBS gedurende 10 min en 1x in PBS gedurende 10 min, bij RT. Beelden werden verkregen met de LI-COR Odyssey CLx Imager. Analyse werd uitgevoerd op FIJI met behulp van de gel analyzer. Het antilichaamsignaal werd genormaliseerd naar het totale REVERT-eiwit.

T4 ligase-gemedieerde DNA-end-joining assay

Elke end-joining-reactie bevat 150 ng van een 1,2 kb DNA PCR-product dat aan de 5′- en 3′-uiteinden is verteerd met cohesief eindrestrictie-enzym XhoI (NEB RO146S). De reacties worden uitgevoerd in een reactievolume van 20 µL dat 150 ng verteerd DNA, 2,8 µL eiwitbuffer (10 mM Tris, 50 mM NaCl pH = 7,6), 5,3 µL 20% glycerol in PBS + Mg + Ca, 2 µL T4 ligase buffer, 200 ng of 40,5 ng eiwit, 25U van T4 ligase (NEB M0202), en steriel H2O tot volume bevat. Alle componenten behalve de T4 ligase werden gecombineerd en geïncubeerd op ijs gedurende 15 min. 25U T4 ligase werd toegevoegd aan de reactie en geïncubeerd bij RT gedurende 90 min. Na incubatie werd de reactie onmiddellijk opgeschoond met een Zymo DNA Clean & ConcentratorTM-5 kolom (Zymo Research) en geëlueerd in 15 µL steriel H2O. SybrGreen en laadbuffer werden aan het DNA toegevoegd en de monsters werden gedurende 1 uur bij 135 V in een 1% agarose TAE-gel geëlektroforeerd en op een Syngene G:BOX chemiluminescentie- en fluorescentiebeeldvormer belicht. ImageJ werd gebruikt om het gelbeeld te analyseren en de gegevens werden grafisch weergegeven met Prism 6 (GraphPad).

Experimentele opzet & statistische analyse

Alle gekwantificeerde waarden worden gerapporteerd als het gemiddelde ± SEM. De relevante steekproef type en aantal (N), en statistische tests gebruikt om significantie te evalueren voor elk experiment worden gepresenteerd met elke dataset. De steekproefgroottes die in elk experiment werden gebruikt, waren gebaseerd op schattingen van verwachte effectgroottes (~10-50%) en standaardafwijkingen van voorlopige gegevens en werden aangedreven om verschillen op te sporen met een 0,05 significantieniveau (α) en 0,9 power (1-β).