Extractie van waterige monsters, gelyseerde cellen of gehomogeniseerd weefsel wordt gemengd met gelijke volumes van een fenol:chloroform-mengsel. Dit mengsel wordt vervolgens gecentrifugeerd. Omdat het fenol:chloroformmengsel niet mengbaar is met water, worden tijdens het centrifugeren twee verschillende fasen gevormd: een bovenste waterige fase en een onderste organische fase. De waterige fase stijgt naar de top omdat deze minder dicht is dan de organische fase die fenol:chloroform bevat. Dit verschil in dichtheid is de reden waarom fenol, dat slechts een iets hogere dichtheid heeft dan water, moet worden gemengd met chloroform om een mengsel te vormen met een veel hogere dichtheid dan water.
De hydrofobe lipiden verdelen zich in de onderste organische fase, en de eiwitten blijven achter in de interfase tussen de twee fasen, terwijl de nucleïnezuren (en andere verontreinigingen zoals zouten, suikers, enz.) achterblijven in de bovenste waterige fase. De bovenste waterige fase kan vervolgens worden afgepipetteerd. Er moet op worden gelet dat geen organische fase of materiaal op het grensvlak wordt afgepipetteerd. Deze procedure wordt vaak meerdere malen uitgevoerd om de zuiverheid van het DNA te verhogen. Deze procedure levert groot dubbelstrengs DNA op dat in PCR of RFLP kan worden gebruikt.
Als het mengsel zuur is, zal het DNA neerslaan in de organische fase, terwijl het RNA in de waterige fase blijft. Dit komt omdat DNA gemakkelijker wordt geneutraliseerd dan RNA.
Er zijn enkele nadelen van deze techniek bij forensisch gebruik. Het is tijdrovend en er worden gevaarlijke reagentia gebruikt. En omdat het een proces in twee stappen is waarbij reagentia van het ene buisje naar het andere moeten worden overgebracht, is er een groter risico van besmetting.