Mit dem Aufkommen gentechnisch veränderter Mäuse ist es nun möglich, jede der drei Komponenten des MCC-Systems (Zilienschlag, Schleimproduktion und Hydratation der Atemwege) isoliert zu untersuchen, ist es nun möglich, jede der drei Komponenten des MCC-Systems (Zilienschlag, Schleimproduktion und Hydratation der Atemwegsoberfläche) isoliert zu untersuchen, um festzustellen, wie sie zusammenwirken, um eine normale MCC zu bewirken. Entscheidend für das Verständnis der Wechselbeziehung zwischen den Komponenten des MCC-Systems ist jedoch die Fähigkeit, die MCC-Rate bei Mäusen genau zu messen.
Es gibt zwar eine Reihe von Studien, in denen MCC bei Mäusen mit verschiedenen Techniken gemessen wurde, doch viele dieser Studien weisen technische Mängel auf, und es wird über eine große Bandbreite von MCC-Raten berichtet. Die in der Literatur angegebenen Raten der trachealen MCC (oder des Partikeltransports) für die „normale Mäusetrachea“ variieren stark von 15 mm/min6 bis 0,031 mm/min21. Ein Großteil der gemeldeten Schwankungen ist wahrscheinlich auf unterschiedliche Techniken zur Messung der MCC sowie auf andere Faktoren (z. B. Mäusestamm, Alter usw.) zurückzuführen8,14.
Eine der ersten Studien, über die berichtet wurde, maß die MCC in den intakten Tracheen lebender Mäuse, indem fluoreszierende Kügelchen von ~3 μm in die Nasenhöhle eingeführt wurden (15 µl Volumen) und dann der Transport der angesaugten Kügelchen durch trans-tracheale Fluoreszenz der Partikel gemessen wurde8. In dieser Studie wurde festgestellt, dass viele Mäuse kein MCC aufwiesen und viele Kügelchen einen „Stop/Go“-Transport zeigten. In dieser Studie wurde auch festgestellt, dass der untersuchte Mäusestamm die Rate der MCC signifikant beeinflusst. In anderen Studien wurde die geringere Clearance der Atemwege bei lebenden Mäusen durch Szintigraphie gemessen, nachdem ein großes Volumen (~50 μl) eines Gammastrahlers in die Atemwege eingebracht worden war9. Beide Studien leiden unter der Instillation eines relativ großen Flüssigkeitsvolumens in die Atemwege und der Störung des Volumens der Oberflächenflüssigkeit der Atemwege, was nachweislich die MCC verändert8,13,22.
Es gibt eine Reihe von Studien in der Literatur, in denen die MCC in der offenen Luftröhre von Mäusen gemessen wurde21,23,24. Diese MCC-Technik mag zwar technisch am einfachsten sein, ist aber wahrscheinlich auch die problematischste, da es schwierig ist, die Temperatur und die normale Hydratation der Atemwege aufrechtzuerhalten, die beide für eine normale MCC von entscheidender Bedeutung sind. Die für diese Präparate berichteten MCC-Raten reichen von 0,031 mm/min bis 4,5 mm/min21,24. MCC in der Maus wurde auch in einem exzidierten Lungenpräparat gemessen25, aber auch bei dieser Methode wurden große Flüssigkeitsvolumina verwendet, ähnlich wie bei den offenen Trachealpräparaten mit deutlicher Überflutung der exzidierten Lunge, was wahrscheinlich die normale MCC stört.
Eine In-vivo-Mikrodialysetechnik wurde erfolgreich eingesetzt, um Störungen der MCC aufgrund genetischer Manipulationen in den unteren Atemwegen der Maus zu identifizieren11. Bei dieser Technik wird eine sehr kleine Mikrodialysesonde auf der Oberfläche der Atemwege platziert13 , und eine kleine Menge Tracer (250 nl) wird distal zum Epithel der Atemwege hinzugefügt. Die Zeit, die der Farbstoff benötigt, um die Sonde zu erreichen, wird aufgezeichnet und MCC berechnet. Diese Technik minimiert zwar die Menge an exogener Flüssigkeit, die der Oberfläche der Atemwege zugeführt wird, ist jedoch zeitaufwändig, erfordert eine kleine Öffnung in der Luftröhre und die Platzierung der Sonde kann MCC stören.
Eine andere Technik, die sehr erfolgreich zur Untersuchung von MCC bei einer Reihe von gentechnisch veränderten Mäusen eingesetzt wurde, beinhaltet die Platzierung einer bekannten Menge fluoreszierender Kügelchen in einer sehr kleinen Flüssigkeitsprobe (~150 nl) direkt in die untere Luftröhre/Hauptbronchien14,26,27,28. Nach 15 Minuten werden die in der Trachea/den Hauptbronchien verbliebenen Beads gezählt und die prozentuale Clearance berechnet. Da zur Einführung der Beads nur ein sehr kleiner Einschnitt in der oberen Trachea vorgenommen wird, kann nicht mit Sicherheit gesagt werden, dass das Flüssigkeitsmilieu an der Oberfläche der Atemwege nicht durch die vorübergehende Platzierung der Bead-Depot-Kanüle oder die geringe Flüssigkeitsmenge, die zur Einführung der Beads verwendet wird, gestört wird. Auch wenn diese Studien anscheinend gute Daten zur Clearance liefern und deutliche Unterschiede in der MCC zwischen WT-Mäusen und Mäusen mit Mutationen, von denen man annimmt, dass sie die MCC stören14,26,27,28, zeigen, werden mit dieser Technik keine tatsächlichen Clearance-Raten erzielt.
Eine optimalere Technik zur Messung der MCC wäre die Einführung eines Tracers in eine lebende Maus, ohne die Luftröhre zu öffnen, und die Verfolgung des Tracers durch die geschlossene Luftröhre. Dies wurde von Donnelley et al.16 berichtet, aber ihre Technik erforderte die Intubation der Maus, um ein trockenes Pulver für die Verfolgung zu verabreichen, und eine teure Ausrüstung für die Bildgebung (ein Synchrotron), die nur an wenigen Orten auf der Welt verfügbar ist. Mit dieser Anordnung waren die Grundraten von MCC sehr niedrig (0,27 mm/min) und die meisten Partikel waren stationär, was wahrscheinlich auf die Austrocknung der Atemwege zurückzuführen ist, da die intubierten Mäuse mit einem FlexVent beatmet wurden und wahrscheinlich trockene Luft atmeten. Wurden die Mäuse nach der Partikelinsufflation 2,5 Minuten lang mit isotonischer NaCl aerosoliert, stieg die MCC-Rate deutlich an und lag im Bereich von 2-3 mm/min, was den in der vorliegenden Untersuchung gemessenen Werten nicht unähnlich ist (die mittlere MCC mit isotonischer NaCl lag in unserer Studie bei 3,3 mm/min).
Kürzlich wurde eine Studie veröffentlicht, in der intubationsfreie In-vivo-Bildgebung mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Messung der MCC bei Mäusen verwendet wurde29. Die Autoren stellten fest, dass die Intubation die genaue MCC-Messung erheblich beeinträchtigt, und kamen daher zu dem Schluss, dass dieses Verfahren bei MCC-Studien an Mäusen vermieden werden sollte. Daher brachten sie den Tracer durch oropharyngeale Aspiration mit einer relativ großen Flüssigkeitsmenge (20 µl) in die Atemwege ein. Ähnlich wie in unserer Studie berichten Veres et al., dass die fluoreszierenden Kügelchen (0,5 um Durchmesser) Aggregatflöße bildeten, die sie verfolgten, um die Gesamtgeschwindigkeit von MCC (~1,1 mm/min) zu bestimmen. Obwohl die von Veres et al. angewandte Methode zur Vorbereitung der Luftröhre für die Visualisierung der in unseren Studien verwendeten Methode sehr ähnlich war, erforderte die Bildgebung mit der Zwei-Photonen-Mikroskopie einen aufwändigeren und kostspieligeren Aufbau im Vergleich zu unserer Methode, die nur ein Präpariergerät mit einer CCD-Kamera und Fluoreszenzbeleuchtung erfordert.
Unsere Methode zur Messung von MCC liefert den Tracer durch nasale Aerosol-Inhalation, wobei den Atemwegen nur sehr wenig Flüssigkeit zugeführt wird (0,095 µl/5-min Aerosol), und die Luftröhre bleibt für die MCC-Messungen geschlossen und intakt. Wichtig ist, dass wir festgestellt haben, dass die MCC-Rate bei lebenden Mäusen oder kurz nach der Euthanasie nahezu identisch war. Dies war insofern überraschend, als wir vermuteten, dass die Euthanasie eine adrenerge Stimulation (oder die Freisetzung anderer Neurotransmitter) auslösen könnte, die die MCC stimulieren könnte30. Das Fehlen der Atmungsexkursion bei euthanasierten Mäusen erleichtert die Partikelbildgebung, so dass MCC-Messungen an einer nicht lebenden Maus technisch einfacher sein könnten als an einem atmenden Tier.
Wir fanden keine signifikante Auswirkung der Dauer der Isofluran-Narkose (5 oder 25 Minuten) auf die Rate der MCC. Die meisten unserer Studien wurden mit Mäusen durchgeführt, die mit Isofluran betäubt wurden. Da jedoch nicht immer ein spezieller Verdampfer zur Verfügung steht und die gleichzeitige Verabreichung von Isofluran und einem Aerosol eine Herausforderung darstellen kann, haben wir eine Reihe von Studien mit dem injizierbaren Anästhetikum Avertin durchgeführt, das weithin verfügbar und nicht von der FDA zugelassen ist, wie viele injizierbare Anästhetika. Die Rate des MCC unterschied sich nicht zwischen den beiden Anästhetika. Obwohl die Anzahl der Perlenflöße, die wir bei den mit Averetin betäubten Mäusen zählten, etwas geringer war als in der Isofluran-Gruppe, war dieser Unterschied nicht signifikant. Bemerkenswert ist, dass in der mit Isofluran betäubten Gruppe signifikant mehr Beads an den Trachealwänden hafteten und die Bead Rafts bei den Avertin-Mäusen signifikant kleiner waren als bei den Isofluran-Mäusen. Wir vermuten, dass diese Unterschiede auf Unterschiede in der Menge der in der Lunge der beiden Mäusegruppen abgelagerten Kügelchen oder in ihrem Ablagerungsmuster zurückzuführen sein könnten, zumal sich die Atemfrequenz und die Tidalvolumina der Mäuse, die die beiden Anästhetika erhielten, unterschieden.
Die Dauer der Aerosolisierung hatte einen signifikanten Einfluss auf die Rate der MCC, und wir stellten fest, dass dies auf die Masse der verabreichten Kügelchen zurückzuführen war, wobei kürzere Aerosolisierungszeiten (5 min) zu höheren Raten der MCC führten als längere Aerosolisierungen (15 min). Es ist unwahrscheinlich, dass ein Unterschied in der Flüssigkeitsabgabe die Ergebnisse erklärt, da Mäuse, die 15 Minuten lang mit 1/3x Beads aerosoliert wurden, ~3 mal so viel Flüssigkeit erhielten wie die Mäuse, die 5 Minuten lang 1x Beads erhielten, und die MCC-Raten dieser beiden Behandlungen sich nicht unterschieden. Bemerkenswert ist, dass eine weitere Verdünnung der Aerosol-Perlen (1/4x für 5 Minuten, Abb. 5B) nicht zu einem weiteren Anstieg der MCC führte. Wenn also zu viele Kügelchen aerosoliert werden, scheinen sie den Transportprozess zu überfordern, und viele werden nicht freigegeben. Doch selbst wenn eine optimale Menge an Kügelchen auf die Atemwege aerosoliert wurde, blieben einige der Kügelchen in vielen Präparaten an den Wänden haften. Zahlreiche andere Forscher haben berichtet, dass die Beads/Partikel in der Luftröhre von Mäusen nicht abtransportiert werden8,16,29.
Im Gegensatz dazu konnten wir, obwohl die Größe und Form der Bead Rafts innerhalb einer Maus und zwischen verschiedenen Mäusen variabel war, keinen Unterschied in der Transportrate in Abhängigkeit von der Raftgröße feststellen. Andere haben auch festgestellt, dass die MCC unabhängig von der Partikelgröße und -form war, aber von der Materialeigenschaft der transportierten Partikel beeinflusst wurde31,32.
Hypertonische Kochsalzlösung erhöht Berichten zufolge das Volumen der Oberflächenflüssigkeit der Atemwege, indem sie osmotisch Flüssigkeit in die Atemwege zieht, und wurde klinisch zur Wiederherstellung/Beschleunigung der MCC eingesetzt18,19. Wir konnten zwar keine signifikante Auswirkung des hohen Salzgehalts auf die MCC-Rate feststellen, aber wir stellten fest, dass die MCC-Rate in der Gruppe mit dem hohen Salzgehalt über den gesamten 10-minütigen Messzeitraum beibehalten wurde, während die MCC-Rate in der Kontrollgruppe nach 5 Minuten abnahm. Diese Daten ähneln denen von Donnelley et al.16, die feststellten, dass ihre Gruppe mit hohem Salzgehalt im Vergleich zu den mit isotonischer Kochsalzlösung behandelten Kontrollen zwar keine höhere MCC-Rate aufwies, die MCC-Rate in der Gruppe mit hohem Salzgehalt jedoch über einen längeren Zeitraum beibehalten wurde, was auf eine vorübergehende Erhöhung der Hydratation der Atemwegsoberfläche schließen lässt. Bemerkenswert ist, dass die Studien von Donnelley et al. in Anwesenheit eines Na+-Kanalblockers durchgeführt wurden, der der Gruppe mit dem hohen Salzgehalt zugesetzt wurde. Da unsere Studien ohne Zugabe eines Na+-Kanalblockers durchgeführt wurden, unterstützt dies die Hypothese, dass hypertone Kochsalzlösung per se den leichten Rückgang der MCC, der nach 5-minütiger Aerosolisierung mit isotoner Kochsalzlösung beobachtet wurde, wiederherstellen kann. Es ist nicht klar, warum in der Gruppe mit dem hohen Salzgehalt weniger Bead Rafts gezählt wurden, da es weder mehr stationäre Partikel noch einen Unterschied in der Größe der Rafts im Vergleich zur isotonischen 5-Minuten-Gruppe zu geben schien.
Da Nukleotide nachweislich die MCC erhöhen, indem sie den CBF, die Oberflächenflüssigkeit der Atemwege und die Schleimsekretion steigern33, untersuchten wir die Wirkung von UTP, wenn es zusammen mit den Tracker-Beads im isotonischen 5-Minuten-Aerosol enthalten war. Wir stellten fest, dass ein 5-minütiges UTP-Aerosol die Clearance-Rate der Kügelchen signifikant erhöhte, was darauf hindeutet, dass eine für die Veränderung von MCC ausreichende Dosis UTP an die Atemwegsoberflächen aerosoliert wurde. Auf der Grundlage früherer Studien ist es wahrscheinlich, dass alle drei Komponenten des mukoziliären Clearance-Systems (Ziliarschlagfrequenz, Muzinsekretion und Hydratation der Atemwegsoberfläche) durch UTP stimuliert wurden, was zu einer allgemeinen Erhöhung der MCC führte. Daher ist unsere Technik besonders nützlich für die Prüfung verschiedener pharmakologischer Präparate, die MCC beeinflussen können.
Schließlich wurde unsere Aerosolisierungsmethode erfolgreich zur Messung von MCC bei 10 Tage alten neonatalen Mäusewelpen eingesetzt. Somit ist diese Methode nützlich, um MCC während der Entwicklung oder in Krankheitsmodellen zu untersuchen, in denen einige der Mutationen, die MCC stören, zu neonataler Letalität führen11,28.
Zusammenfassend haben wir eine einfache, kostengünstige Methode entwickelt, um MCC in Mäusen in vivo zu bestimmen (siehe ergänzende Tabelle S1 für optimale Parameter für MCC-Messungen, wie sie in dieser Studie ermittelt wurden). Unsere Methode nutzt die Aerosolisierung und trans-tracheale Verfolgung von fluoreszierenden Kügelchen zur MCC-Bestimmung und hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen in der Literatur beschriebenen MCC-Methoden. Erstens muss die Luftröhre für die Einführung des Tracers nicht geöffnet (oder intubiert) werden, und es wird nur ein sehr kleines Flüssigkeitsvolumen mit den Tracerkügelchen eingeatmet, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Störung des Milieus der Atemwegsoberflächenflüssigkeit verringert wird. Zweitens können wir das Verhalten der Kügelchen während der Clearance visualisieren, was neben der tatsächlichen MCC-Rate zusätzliche Informationen über die durch eine bestimmte Intervention hervorgerufenen Veränderungen liefern kann, z. B. Migrationsmuster, Verklumpung und/oder Abweichung von gleichmäßigen Trajektorien. Drittens haben wir diese Methode erfolgreich zur Untersuchung von MCC bei sehr jungen Mäusewelpen eingesetzt. Da diese Methode nicht notwendigerweise terminal ist, kann sie an lebenden Mäusen durchgeführt werden und MCC vor und nach einer medikamentösen Behandlung untersuchen. Außerdem erhalten wir nahezu identische Raten von MCC bei lebenden oder nach der Euthanasie getöteten Mäusen. Schließlich ist die für diese Studien erforderliche Ausrüstung relativ kostengünstig und leicht zu beschaffen und wird es hoffentlich Labors, die Störungen der Komponenten des MCC-Systems untersuchen, ermöglichen, MCC in diesen Mäusen tatsächlich zu messen.