Macchio a commencé à prendre des cours de claquettes à l’âge de 3 ans et a été découvert par un agent de talent alors qu’il avait 16 ans. Il a ensuite obtenu le rôle de Jeremy Andretti dans la série télévisée Huit est assez. Après la fin de Eight is Enough, il a obtenu le rôle de Johnny Cade dans le film The Outsiders en 1983. C’est ce rôle qui l’a amené à jouer le rôle de Daniel LaRusso dans le film de 1984, The Karate Kid et deux de ses suites, The Karate Kid Part II et The Karate Kid Part III. Macchio est apparu dans le film Crossroads en 1986, où il a joué le rôle d’un étudiant en musique, Eugene Martone. Toujours en 1986, Macchio a joué dans Cuba et son ours en peluche à Broadway, aux côtés de Robert DeNiro. En 1992, il joue aux côtés de Joe Pesci et Marisa Tomei dans la comédie à succès Mon cousin Vinny, où il incarne Billy Gambini, accusé à tort de meurtre alors qu’il est de passage dans une petite ville d’Alabama. En 1996, Macchio a interprété le rôle principal de J. Pierrepont Finch dans la reprise de la tournée américaine de la comédie musicale How to Succeed in Business Without Really Trying, récompensée par un Tony Award en 1962, et a reçu des critiques positives. Se référant à sa performance en tant que choriste dans une production lycéenne de la même comédie musicale, Macchio a déclaré : « J’étais connu comme le ‘Dancing Kid’, non pas que j’étais si génial. Mais je dansais depuis l’âge de trois ans, en prenant des cours à la June Claire School of Dance à Babylon, Long Island. »
En 2005, Macchio a joué son propre rôle dans la série HBO, Entourage. En 2007, il est apparu dans le clip de la chanson « Sweep the Leg » de No More Kings en tant que caricature de lui-même et de Daniel de The Karate Kid. En 2008, il est apparu dans une publicité VitaminWater mettant en scène le pilote de NASCAR Carl Edwards. Macchio était représenté comme le « conseiller spirituel » d’Edwards et portait ses vêtements de Karaté Kid. Depuis octobre 2008, il est apparu dans plusieurs épisodes de la série télévisée Ugly Betty d’ABC Network dans le rôle d’Archie Rodriguez, un politicien local, avec un rôle semi-régulier en tant qu’intérêt amoureux de Hilda dans la série. En novembre 2008, Macchio a été classé n°80 parmi les 100 plus grandes stars adolescentes de VH1.
En juin 2010, Macchio est apparu dans le court-métrage en ligne de Funny or Die, « Wax On, F*ck Off », dans lequel ses proches mettent en scène une intervention pour transformer l’ancien enfant star d’un père de famille équilibré en un toxicomane assailli par les scandales des tabloïds, tout cela pour aider sa carrière. Pendant la vidéo, Macchio réagit à la vue d’une affiche pour le remake 2010 de Karate Kid. Une blague récurrente dans le sketch est que Macchio est confondu avec un adolescent. Le court-métrage a été salué par Bruce Fretts, de TV Guide, qui l’a qualifié de « désopilant » et d' »or comique ». Le 20 septembre 2010, Macchio a joué le rôle de l’adulte Carl Morelli dans une mise en scène de la pièce de Charles Messina, A Room of My Own, présentée par la Bleecker Street Theater Company. En février 2011, il a été annoncé qu’il participerait à l’émission Dancing with the Stars sur ABC. Il a été éliminé pendant les demi-finales, se classant quatrième dans la compétition globale. Macchio est apparu dans les clips du groupe canadien Danko Jones pour « Had Enough » et « I Think Bad Thoughts », avec également Elijah Wood et Jena Malone.
En avril 2012, Macchio est au casting du film Hitchcock, basé sur le livre non fictionnel Alfred Hitchcock and the Making of Psycho, avec Anthony Hopkins, Helen Mirren, Scarlett Johansson, Jessica Biel et Toni Collette, et réalisé par Sacha Gervasi. Macchio y interprète le scénariste de Psychose, Joseph Stefano. En 2013, il est apparu dans How I Met Your Mother. Le personnage principal, Barney Stinson, affirme que le personnage de Macchio, Daniel LaRusso, dans The Karate Kid, n’est pas le vrai karatéka ; il s’agit plutôt de Johnny Lawrence, l’ennemi juré de Daniel dans le film. Dans l’épisode de la 8e saison « The Bro Mitzvah », Macchio est invité à l’enterrement de vie de garçon de Barney, mais ce dernier est déçu de la surprise, s’attendant à voir l’acteur William Zabka, le « vrai Karaté Kid ». Pendant toute la durée de l’épisode, les personnages notent les similitudes entre Barney et Macchio, au grand dégoût de Barney. À la fin de la soirée, le clown engagé pour l’animation de la fête se révèle être Zabka. De février à mars 2016, Macchio a partagé la vedette avec Mario Cantone dans la production Off-Broadway A Room of My Own, après avoir lu la pièce en 2010 et 2014.
Macchio reprend actuellement son rôle de Daniel LaRusso dans Cobra Kai, une série Netflix de comédie dramatique d’action présentée dans un format de narration épisodique, qui a débuté en 2018. Il est également co-producteur exécutif de la série, aux côtés de William Zabka. La série se déroule 34 ans après les événements du tournoi de karaté All Valley de 1984 et tourne autour d’un Johnny Lawrence (Zabka) en perte de vitesse qui – cherchant à remettre sa vie sur les rails et à obtenir la rédemption pour sa défaite au tournoi de 1984 – rouvre le dojo Cobra Kai. Cela ravive sa rivalité avec un LaRusso désormais prospère, qui s’efforce de maintenir l’équilibre dans sa vie sans les conseils de son mentor, M. Miyagi, aujourd’hui décédé.