Met de komst van genetisch gemanipuleerde muizen, is het nu mogelijk om elk van de drie componenten van het MCC systeem (ciliary beat, mucus productie, en luchtweg oppervlakte hydratatie) in isolatie te bestuderen om te bepalen hoe ze interageren om normale MCC te beïnvloeden. Echter, van cruciaal belang voor ons vermogen om de onderlinge relatie tussen de componenten van het MCC systeem te begrijpen is de mogelijkheid om nauwkeurig de snelheid van MCC in muizen te meten.
Hoewel een aantal studies MCC in muizen hebben gemeten met behulp van een verscheidenheid aan technieken, hebben veel van de studies technische tekortkomingen en wordt een breed scala van MCC percentages gerapporteerd. Snelheden van tracheale MCC (of deeltjes transport) voor de “normale muis trachea” gerapporteerd in de literatuur verschillen sterk van 15 mm/min6 tot 0,031 mm/min21. Veel van de variabiliteit gemeld is waarschijnlijk te wijten aan verschillen in technieken gebruikt om MCC te meten, naast andere factoren (bijvoorbeeld stam van muizen, leeftijd, enz.) 8,14.
Een van de vroegste studies gemeld gemeten MCC in de intacte luchtpijp van levende muizen door de invoering ~ 3 micrometer fluorescerende kralen in de neusholte (15 µl volume) en vervolgens het meten van het transport van de opgezogen kralen door trans-tracheale fluorescentie van de deeltjes 8. Uit deze studie bleek dat veel muizen geen MCC vertoonden en dat veel korrels een “stop/go”-type van transport vertoonden. Uit deze studie bleek ook dat de stam van de onderzochte muizen een aanzienlijke invloed had op de snelheid van MCC. Anderen hebben bij levende muizen een lagere klaring van de luchtwegen gemeten met behulp van scintigrafie na het inbrengen van een groot volume (~50 μl) van een gamma-emitter in de luchtwegen9. Beide studies lijden van instilleren een relatief groot volume van de vloeistof op de luchtwegen en verstoring van het volume van de luchtweg oppervlak vloeistof, waarvan is aangetoond dat MCC 8,13,22 veranderen
Er zijn een aantal studies in de literatuur waarin MCC werd gemeten in de open murine trachea 21,23,24. Hoewel deze MCC techniek kan technisch de gemakkelijkste, is het waarschijnlijk de meest problematische te wijten aan de moeilijkheid om de temperatuur en de normale luchtweg hydratatie, die beide zijn van cruciaal belang voor een normale MCC. De MCC-snelheden die voor deze preparaten zijn gerapporteerd, variëren van 0,031 mm/min tot 4,5 mm/min21,24. MCC in de muis is ook gemeten in een geëxcideerde long preparaat 25, maar deze methode ook gebruik gemaakt van grote volumes vloeistof, vergelijkbaar met de open tracheale preparaten met duidelijke overstroming van de geëxcideerde long, waarschijnlijk verstoren normale MCC.
Een in vivo microdialyse techniek is met succes gebruikt om verstoringen in MCC als gevolg van genetische manipulatie in de lagere luchtwegen in de muis 11 vast te stellen. Bij deze techniek wordt een zeer kleine microdialysesonde op het oppervlak van de luchtwegen geplaatst13 en wordt een klein volume tracer (250 nl) distaal aan het epitheel van de luchtwegen toegevoegd. De tijd die de kleurstof nodig heeft om de sonde te bereiken, wordt geregistreerd en het MCC wordt berekend. Terwijl deze techniek minimaliseert de hoeveelheid exogene vloeistof toegevoegd aan de luchtwegen oppervlak, het is enigszins tijdrovend, vereist het plaatsen van een kleine opening in de luchtpijp, en de plaatsing van de sonde kan verstoren MCC.
Een andere techniek die zeer succesvol is gebruikt om MCC studie op een aantal genetisch gemanipuleerde muizen gaat het plaatsen van een bekende hoeveelheid fluorescerende bolletjes in een zeer klein vloeibaar monster (~ 150 nl) direct in de onderste luchtpijp / bronchi hoofdsteel 14,26,27,28. Na 15 min, worden de kralen resterende in de trachea/hoofdsteel bronchiën geteld en procent klaring wordt berekend. Hoewel slechts een zeer kleine incisie in de bovenste luchtpijp wordt gemaakt om de korrels in te brengen, kan niet met zekerheid worden gesteld dat het vloeistofmilieu aan het oppervlak van de luchtwegen niet wordt verstoord door de kortstondige plaatsing van de canule voor de toediening van korrels of het kleine volume vloeistof dat wordt gebruikt om de korrels in te brengen. Ook terwijl deze studies lijken goede klaring gegevens opleveren en duidelijke verschillen in MCC tussen WT en muizen met mutaties naar verwachting verstoren MCC 14,26,27,28, worden de werkelijke tarieven van de klaring niet verkregen met deze techniek.
Een meer optimale techniek om MCC te meten zou inhouden introductie van een tracer in een levende muis zonder opening van de luchtpijp en tracer tracking door de gesloten luchtpijp. Dit is gerapporteerd door Donnelley et al.16, maar hun techniek vereiste intubatie van de muis om een droog poeder voor tracering toe te dienen en dure apparatuur voor beeldvorming (een synchrotron) die slechts op enkele plaatsen in de wereld beschikbaar is. Met deze opstelling was de basale snelheid van MCC zeer laag (0,27 mm/min) en de meerderheid van de deeltjes was stationair, waarschijnlijk als gevolg van uitdroging van de luchtwegen, aangezien de geïntubeerde muizen werden geventileerd met een FlexVent en waarschijnlijk droge lucht ademden. Wanneer de muizen werden aerosolized voor 2,5 min met isotone NaCl na deeltjes insufflatie, de snelheid van MCC aanzienlijk toegenomen en was in het bereik van 2-3 mm / min, niet ongelijk aan wat we gemeten in het huidige onderzoek (gemiddelde MCC met isotone NaCl in onze studie was 3,3 mm / min).
Een studie werd onlangs gepubliceerd waarin intubatie-vrije in vivo beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie werd gebruikt om MCC te meten bij muizen29. Inderdaad, de auteurs vonden dat intubatie duidelijk verstoord nauwkeurige MCC meting en dus geconcludeerd dat deze procedure moet worden vermeden in murine MCC studies. Zo introduceerden zij de tracer in de luchtwegen door orofaryngeale aspiratie met behulp van een relatief groot volume vloeistof (20 µl). Vergelijkbaar met wat we waargenomen in onze studie, Veres et al. melden dat de fluorescerende kralen (0,5 um diameter) gevormd aggregaat vlotten, die zij gevolgd om de over-all snelheid van MCC (~ 1,1 mm / min) te bepalen. Hoewel de methode die door Veres et al. aan de luchtpijp voor te bereiden voor visualisatie was zeer vergelijkbaar met degene die in onze studies, beeldvorming met twee-foton microscopie vereist een meer uitgebreide en kostbare set-up in vergelijking met onze methode, die alleen een dissecteren scope gekoppeld met een CCD-camera en fluorescerende verlichting vereist.
Onze methode om MCC te meten levert de tracer via nasale aërosol inhalatie, het toevoegen van zeer weinig volume van de vloeistof aan de luchtwegen (0,095 µl/5-min aerosol), en de luchtpijp blijft gesloten en intact voor de MCC metingen. Belangrijk is dat we ontdekten dat de snelheid van MCC bijna identiek was bij levende muizen of kort na euthanasie. Dit was nogal verrassend als we speculeerden euthanasie zou adrenerge stimulatie (of afgifte van andere neurotransmitters) die MCC30 zou kunnen stimuleren veroorzaken. De afwezigheid van respiratoire excursie in geëuthanaseerde muizen vergemakkelijkt partikel beeldvorming, en dus MCC metingen op een niet-levende muis kan technisch eenvoudiger dan het uitvoeren van dergelijke metingen op een ademend dier.
We vonden geen significant effect van de lengte van de isofluraan anesthesie (5 of 25 min) op de snelheid van MCC. De meeste van onze studies werden uitgevoerd met muizen die werden verdoofd met isofluraananesthesie, maar omdat toegang tot een speciale verdamper misschien niet altijd beschikbaar is en gelijktijdige toediening van isofluraan en een aërosol een uitdaging kan zijn, voerden we een reeks studies uit met het injecteerbare verdovingsmiddel Avertin, dat overal verkrijgbaar is en niet door de FDA is gereguleerd, zoals veel injecteerbare verdovingsmiddelen zijn. De snelheid van MCC was niet verschillend tussen de twee verdovingsmiddelen. Hoewel het aantal korrels dat we telden in de muizen met Avertin-anesthesie iets minder was dan in de isofluraan-groep, was dit verschil niet significant. Opmerkelijk is dat in de isofluraan-verdoofde groep significant meer korrels aan de wanden van de luchtpijp kleefden en dat de kraalvlotten in de Avertin muizen significant kleiner waren dan die in de isofluraan muizen. Wij veronderstellen dat deze verschillen te wijten kunnen zijn aan verschillen in de hoeveelheid korrels die in de longen van de twee groepen muizen werden afgezet, of in hun afzettingspatroon, vooral omdat de ademhalingsfrequentie en het ademteugvolume verschilden tussen de muizen die de twee verdovingsmiddelen toegediend kregen.
De duur van de aerosolisatie had een significant effect op de snelheid van MCC, en wij stelden vast dat dit te wijten was aan de massa van de toegediende korrels, waarbij kortere aerosolisatieperioden (5 min) een grotere snelheid van MCC opleverden dan langere aerosolisatieperioden (15 min). Het is onwaarschijnlijk dat een verschil in vloeistofafgifte de resultaten verklaart omdat muizen die gedurende 15 min. 1/3x korrels kregen toegediend ~3 maal zoveel vloeistof ontvingen als de muizen die gedurende 5 min. 1x korrels kregen toegediend, en de percentages MCC van deze twee behandelingen niet verschilden. Van de nota, verdere verdunning van de aerosol kralen (1/4x voor 5 min, Fig. 5B) resulteerde niet in een verdere toename van MCC. Als er dus te veel korrels in de aërosol worden gebracht, lijken ze het transportproces te overweldigen en veel korrels worden niet vrijgemaakt. Zelfs wanneer een optimale massa korrels in de luchtwegen werd geïnjecteerd, bleef bij veel van de preparaten een deel van de korrels aan de wanden kleven. Tal van andere onderzoekers hebben gemeld kralen / deeltjes niet duidelijk in de muizen trachea 8,16,29.
In tegenstelling, terwijl de grootte en de vorm van de bead rafts waren variabel binnen een muis en tussen muizen, hebben we geen verschil in de snelheid van het transport als functie van raft grootte te detecteren. Anderen hebben ook opgemerkt dat MCC onafhankelijk was van deeltjesgrootte en -vorm, maar werd beïnvloed door de materiaaleigenschap van de getransporteerde deeltjes31,32.
Hypertonische zoutoplossing is gemeld om het volume van luchtwegoppervlak vloeistof te verhogen door osmotisch vloeistof in de luchtwegen te trekken en is klinisch gebruikt om MCC te herstellen / versnellen18,19. Hoewel we geen significant effect van het hoge zout op de snelheid van MCC zagen, merkten we wel op dat de snelheid van MCC gedurende de 10-minuten meetperiode in de groep met het hoge zout gehandhaafd bleef, terwijl de snelheid van MCC na 5 minuten in de controlegroep afnam. Deze gegevens zijn vergelijkbaar met die gerapporteerd door Donnelley et al.16, die waargenomen dat hoewel hun hoog zout groep niet vertonen een grotere snelheid van MCC in vergelijking met controles behandeld met isotone zoutoplossing, de snelheid van MCC werd gehandhaafd voor langere perioden in de hoog zout groep, wat suggereert een tijdelijke toename in luchtweg oppervlakte hydratatie. Opmerkelijk is dat de studies van Donnelley et al. werden uitgevoerd in aanwezigheid van een Na+ kanaal blokker toegevoegd aan de hoog zout groep. Aangezien onze studies werden uitgevoerd zonder toevoeging van een Na+ kanaal blokker, ondersteunt dit de hypothese dat hypertonische zoutoplossing op zich de lichte daling in MCC kan herstellen die werd waargenomen na 5-min aerosolisatie met isotone zoutoplossing. Het is niet duidelijk waarom er minder bead rafts werden geteld in de hoog zout groep, aangezien er niet meer stationaire deeltjes leken te zijn noch een verschil in grootte van de rafts vergeleken met de 5-min isotone groep.
Aangezien van nucleotiden is aangetoond dat ze MCC verhogen door verhoging van CBF, luchtwegoppervlak vloeistof, en mucus secretie33, onderzochten we het effect van UTP wanneer opgenomen in de isotone 5-min aerosol samen met de tracker beads. Wij vonden dat een 5-minuten aerosol met UTP de klaringssnelheid van de korrels aanzienlijk verhoogde, wat suggereert dat een dosis UTP die voldoende is om MCC te wijzigen naar de luchtwegoppervlakken werd geaerosoliseerd. Gebaseerd op eerdere studies is het waarschijnlijk dat alle drie componenten van het mucociliaire klaringssysteem (ciliary beat frequentie, mucine secretie, en luchtwegoppervlak hydratatie), werden gestimuleerd door UTP om te resulteren in een algemene toename van MCC. Zo zal onze techniek vooral nuttig zijn voor het testen van verschillende farmacologische preparaten die MCC.
Finitief, onze aerosolization methode is gebruikt om met succes MCC meten in 10-dagen oude neonatale muis pups. Dus deze methode zal nuttig zijn om MCC te bestuderen tijdens de ontwikkeling of in ziektemodellen waarin een aantal van de mutaties die MCC verstoren zijn gevonden om te resulteren in neonatale letaliteit 11,28.
In samenvatting, hebben we een eenvoudige, goedkope methode om MCC te bepalen in muizen in vivo (zie aanvullende tabel S1 voor optimale parameters voor MCC metingen zoals bepaald in deze studie). Onze methode maakt gebruik van aerosolisatie en trans-tracheale tracking van fluorescerende bolletjes voor MCC bepaling en heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere MCC methoden gerapporteerd in de literatuur. Ten eerste, de luchtpijp hoeft niet te worden geopend (of geïntubeerd) voor de invoering van de tracer, en slechts een zeer klein volume van de vloeistof wordt ingeademd met de tracer kralen, waardoor de kans op verstoring van het milieu van de luchtweg oppervlakte vloeistof. Ten tweede kunnen we het gedrag van de korrels tijdens de klaring visualiseren, wat naast de werkelijke snelheid van MCC aanvullende informatie kan opleveren over de veranderingen die een bepaalde interventie teweegbrengt, d.w.z. migratiepatronen, klontering, en/of afwijking van uniforme trajecten. Ten derde hebben wij deze methode met succes gebruikt om MCC in zeer jonge muizenpups te bestuderen. Aangezien deze methode niet noodzakelijkerwijs terminaal is, kan zij bovendien worden uitgevoerd op levende muizen en kan zij worden gebruikt om MCC te bestuderen vóór en na de behandeling met geneesmiddelen. Bovendien verkrijgen wij vrijwel identieke percentages MCC bij levende muizen en muizen na euthanasie. Tenslotte is de apparatuur die nodig is voor deze studies relatief goedkoop en gemakkelijk te verkrijgen en hopelijk zullen laboratoria die verstoringen in de componenten van het MCC-systeem bestuderen, MCC in deze muizen kunnen meten.