Macchio begon op 3-jarige leeftijd met tapdanslessen en werd ontdekt door een talentagent toen hij 16 jaar oud was. Hij werd toen gecast als Jeremy Andretti in de televisieserie Eight Is Enough. Nadat Eight is Enough was afgelopen, kreeg hij de rol van Johnny Cade in de film The Outsiders uit 1983. Het was deze rol die hem leidde tot de rol van Daniel LaRusso in de film The Karate Kid uit 1984 en twee van zijn vervolgen, The Karate Kid Part II en The Karate Kid Part III. Macchio speelde in 1986 in de film Crossroads, als muziekstudent Eugene Martone. Ook in 1986 speelde Macchio in Cuba and His Teddy Bear op Broadway, naast Robert DeNiro. In 1992 speelde hij tegenover Joe Pesci en Marisa Tomei in de komedie My Cousin Vinny, waarin hij de rol vertolkte van Billy Gambini, die ten onrechte beschuldigd werd van moord terwijl hij op doorreis was in een klein stadje in Alabama. In 1996 vertolkte Macchio de hoofdrol van J. Pierrepont Finch in de reprise van de Tony Award-winnende musical How to Succeed in Business Without Really Trying uit 1962, die in de VS een tournee beleefde en positieve kritieken kreeg. Verwijzend naar zijn optreden als koorknaap in een middelbare school productie van dezelfde musical, zei Macchio: “Ik stond bekend als de ‘Dancing Kid,’ niet dat ik zo goed was. Maar ik danste al vanaf mijn derde jaar en nam lessen aan de June Claire School of Dance in Babylon, Long Island.”
In 2005 speelde Macchio zichzelf in de HBO-serie Entourage. In 2007 was hij te zien in de videoclip van het nummer “Sweep the Leg” van No More Kings als een karikatuur van zichzelf en Daniel uit The Karate Kid. In 2008 verscheen hij in een VitaminWater reclame waarin NASCAR coureur Carl Edwards te zien was. Macchio werd afgebeeld als Edwards’ “spirituele adviseur” en gekleed in zijn Karate Kid kleren. Sinds oktober 2008 is hij te zien in verschillende afleveringen van de ABC Network televisieserie Ugly Betty als Archie Rodriguez, een lokale politicus, met een semi-regelmatige rol als Hilda’s love interest in de show. In november 2008 stond Macchio op nummer 80 van VH1’s 100 Greatest Teen Stars.
In juni 2010 verscheen Macchio in Funny or Die’s online korte film “Wax On, F*ck Off”, waarin zijn dierbaren een interventie organiseren om de voormalige kindster te veranderen van een goed aangepaste familieman in een verslaafde die wordt belaagd door roddelbladen, allemaal om zijn carrière te helpen. Tijdens de video reageert Macchio op het zien van een poster voor de remake van Karate Kid in 2010. Een terugkerende grap in de sketch is dat Macchio wordt verward met een puber. Het filmpje werd geprezen door Bruce Fretts van TV Guide, die de video “sidesplitting” en “comic gold” noemde. Op 20 september 2010 speelde Macchio de volwassen Carl Morelli in een geënsceneerde lezing van het Charles Messina toneelstuk A Room of My Own gepresenteerd door de Bleecker Street Theater Company. In februari 2011 werd aangekondigd dat hij zou meedoen aan ABC’s Dancing with the Stars. Hij werd tijdens de halve finales uitgeschakeld en werd vierde in de algemene competitie. Macchio verscheen in de videoclips van de Canadese band Danko Jones voor “Had Enough” en “I Think Bad Thoughts”, met Elijah Wood en Jena Malone.
In april 2012 werd Macchio gecast in de film Hitchcock, gebaseerd op het non-fictie boek Alfred Hitchcock and the Making of Psycho, met in de hoofdrollen Anthony Hopkins, Helen Mirren, Scarlett Johansson, Jessica Biel en Toni Collette, en geregisseerd door Sacha Gervasi. Macchio portretteert Psycho-scenarist Joseph Stefano. In 2013 was hij te zien in How I Met Your Mother. Het hoofdpersonage, Barney Stinson, beweert dat Macchio’s personage, Daniel LaRusso, in The Karate Kid niet de echte karate kid is; in plaats daarvan is het Johnny Lawrence, Daniel’s nemesis in de film. In de aflevering “The Bro Mitzvah” van het achtste seizoen wordt Macchio uitgenodigd op Barney’s vrijgezellenfeest, hoewel Barney teleurgesteld is in de verrassing, omdat hij acteur William Zabka verwachtte, de “echte Karate Kid”. Gedurende de hele aflevering merken de personages de gelijkenissen tussen Barney en Macchio op, tot Barney’s afschuw. Aan het eind van de avond onthult de clown die voor het vermaak van het feest is ingehuurd, dat hij Zabka is. Van februari tot maart 2016 speelde Macchio samen met Mario Cantone in de Off-Broadway-productie A Room of My Own, nadat hij het stuk in 2010 en 2014 had gelezen.
Macchio herneemt momenteel zijn rol als Daniel LaRusso in Cobra Kai, een actie-komedie-drama Netflix-serie die wordt gepresenteerd in een episodisch vertelformaat, dat begon in 2018. Hij is ook een mede-uitvoerende producent van de serie, samen met William Zabka. De serie speelt zich 34 jaar na de gebeurtenissen van het All Valley Karate Tournament van 1984 af en draait om een down-and-out Johnny Lawrence (Zabka) die – op zoek om zijn leven weer op de rails te krijgen en verlossing te krijgen voor zijn nederlaag in het toernooi van 1984 – de Cobra Kai dojo heropent. Dit doet zijn rivaliteit met de nu succesvolle LaRusso weer oplaaien, die worstelt om zijn leven in balans te houden zonder de begeleiding van zijn inmiddels overleden mentor, Mr Miyagi.