Macchio rozpoczął lekcje stepowania w wieku 3 lat i został odkryty przez agenta talentów, gdy miał 16 lat. Został wtedy obsadzony w roli Jeremy’ego Andretti w serialu telewizyjnym Eight Is Enough. Po zakończeniu „Eight is Enough” zdobył rolę Johnny’ego Cade’a w filmie „The Outsiders” z 1983 roku. To właśnie ta rola doprowadziła do obsadzenia go w roli Daniela LaRusso w filmie Karate Kid z 1984 roku oraz w dwóch jego sequelach, Karate Kid Part II i Karate Kid Part III. Macchio pojawił się w filmie Crossroads z 1986 roku, grając studenta muzyki Eugene Martone. Również w 1986 roku, Macchio wystąpił na Broadwayu w filmie Cuba and His Teddy Bear, u boku Roberta DeNiro. W 1992 roku wystąpił u boku Joe Pesci i Marisy Tomei w przebojowej komedii Mój kuzyn Vinny, grając Billy’ego Gambiniego, który został niesłusznie oskarżony o morderstwo podczas przejazdu przez małe miasteczko w Alabamie. W 1996 roku Macchio zagrał główną rolę J. Pierreponta Fincha w amerykańskim odrodzeniu nagrodzonego Tony Award musicalu How to Succeed in Business Without Really Trying z 1962 roku i otrzymał pozytywne recenzje. Nawiązując do swojego występu jako chórzysta w licealnej produkcji tego samego musicalu, Macchio powiedział: „Byłem znany jako 'Tańczący Dzieciak’, nie żebym był aż tak świetny. Ale tańczyłem od trzeciego roku życia, biorąc lekcje w June Claire School of Dance w Babylon, Long Island.”
W 2005 roku Macchio zagrał samego siebie w serialu HBO, Entourage. Pojawił się w teledysku z 2007 roku do piosenki „Sweep the Leg” zespołu No More Kings jako karykatura siebie i Daniela z filmu The Karate Kid. W 2008 roku pojawił się w reklamie VitaminWater, w której wystąpił kierowca NASCAR Carl Edwards. Macchio został przedstawiony jako „duchowy doradca” Edwardsa i ubrany w swoje stroje z Karate Kid. Od października 2008 roku pojawił się w kilku odcinkach serialu telewizyjnego ABC Network Ugly Betty jako Archie Rodriguez, lokalny polityk, z pół-regularną rolą jako zainteresowanie miłością Hildy na pokazie. W listopadzie 2008 roku Macchio został sklasyfikowany na 80. miejscu wśród 100 największych nastoletnich gwiazd VH1.
W czerwcu 2010 roku Macchio pojawił się w filmie Funny or Die, „Wax On, F*ck Off”, w którym jego bliscy przeprowadzają interwencję, aby zmienić byłą gwiazdę dziecięcą z dobrze ułożonego człowieka rodzinnego w uzależnionego od skandali tabloidów, a wszystko po to, aby pomóc mu w karierze. W trakcie filmu Macchio reaguje na plakat remake’u Karate Kid z 2010 roku. Powtarzającym się żartem w skeczu jest to, że Macchio jest mylony z nastolatkiem. Skecz został pochwalony przez Bruce’a Frettsa z TV Guide, który określił go jako „sidesplitting” i „comic gold”. 20 września 2010 roku, Macchio zagrał dorosłego Carla Morelli w inscenizacji sztuki Charlesa Messiny A Room of My Own zaprezentowanej przez Bleecker Street Theater Company. W lutym 2011 roku ogłoszono, że weźmie udział w programie ABC „Taniec z gwiazdami”. Został wyeliminowany podczas półfinałów, zajmując czwarte miejsce w ogólnej rywalizacji. Macchio pojawił się w teledyskach kanadyjskiego zespołu Danko Jones do utworów „Had Enough” i „I Think Bad Thoughts”, w których wystąpili również Elijah Wood i Jena Malone.
W kwietniu 2012 roku Macchio znalazł się w obsadzie filmu Hitchcock, opartego na książce Alfred Hitchcock and the Making of Psycho, z udziałem Anthony’ego Hopkinsa, Helen Mirren, Scarlett Johansson, Jessiki Biel i Toni Collette, w reżyserii Sachy Gervasiego. Macchio portretuje scenarzystę filmu Psycho, Josepha Stefano. W 2013 roku pojawił się w serialu How I Met Your Mother. Główny bohater, Barney Stinson, twierdzi, że postać Macchio, Daniel LaRusso, w The Karate Kid nie jest prawdziwym dzieckiem karate; zamiast tego jest to Johnny Lawrence, nemezis Daniela w filmie. W 8. odcinku sezonu „Bro Mitzvah”, Macchio jest zaproszony na wieczór kawalerski Barneya, chociaż Barney jest rozczarowany niespodzianką, spodziewając się aktora William Zabka, „prawdziwy Karate Kid”. Przez cały czas trwania odcinka, znaki zauważyć podobieństwa między Barney i Macchio, do obrzydzenia Barneya. Pod koniec nocy, klaun wynajęty do rozrywki na imprezie ujawnia się być Zabka. Od lutego do marca 2016 roku Macchio współtworzył z Mario Cantone w produkcji Off-Broadway A Room of My Own, po przeczytaniu sztuki w 2010 i 2014 roku.
Macchio obecnie powtarza swoją rolę jako Daniel LaRusso w Cobra Kai, komediodramacie akcji serialu Netflix przedstawionym w epizodycznym formacie opowiadania, który rozpoczął się w 2018 roku. Jest również współproducentem wykonawczym serialu, wraz z Williamem Zabką. Akcja serialu rozgrywa się 34 lata po wydarzeniach z turnieju karate All Valley 1984 i obraca się wokół zdołowanego Johnny’ego Lawrence’a (Zabka), który – chcąc przywrócić swoje życie na właściwe tory i uzyskać odkupienie za porażkę w turnieju z 1984 roku – ponownie otwiera dojo Cobra Kai. To reignites jego rywalizację z teraz-successful LaRusso, który został zmagania w celu utrzymania równowagi w swoim życiu bez wskazówek jego teraz zmarłego mentora, Pan Miyagi.