Macchio começou a dançar sapateado aos 3 anos de idade e foi descoberto por um agente de talentos quando tinha 16 anos de idade. Ele foi então escolhido como Jeremy Andretti na série de televisão Eight Is Enough. Após o filme Eight is Enough, ele ganhou o papel de Johnny Cade no filme The Outsiders, de 1983. Foi este papel que o levou a ser elenco de Daniel LaRusso no filme de 1984, The Karate Kid e duas de suas sequelas, The Karate Kid Part II e The Karate Kid Part III. Macchio apareceu no filme Crossroads, de 1986, retratando o estudante de música Eugene Martone. Também em 1986, Macchio estrelou em Cuba e Seu Urso de Pelúcia na Broadway, ao lado de Robert DeNiro. Em 1992, ele estrelou ao lado de Joe Pesci e Marisa Tomei na comédia de sucesso My Cousin Vinny, interpretando Billy Gambini, acusado injustamente de assassinato enquanto passava por uma pequena cidade do Alabama. Em 1996, Macchio interpretou o papel principal de J. Pierrepont Finch no reavivamento da turnê americana do musical premiado com o Tony How to Succeed in Business Without Really Trying, de 1962, e recebeu críticas positivas. Referindo-se à sua actuação como corista numa produção do mesmo musical, Macchio disse: “Eu era conhecido como o ‘Dancing Kid’, não que eu fosse assim tão bom. Mas eu já dançava desde os três anos de idade, tendo aulas na Escola de Dança Claire de Junho na Babilónia, Long Island”
Em 2005, Macchio tocou ele próprio na série HBO, Entourage. Ele apareceu no vídeo musical de 2007 para a música “Sweep the Leg” de No More Kings como uma caricatura de si mesmo e do Daniel do The Karate Kid. Em 2008, ele apareceu em um comercial da VitaminWater que apresentou o piloto da NASCAR Carl Edwards. Macchio foi retratado como o “conselheiro espiritual” de Edwards e vestido com as suas roupas de Karate Kid. Desde outubro de 2008, ele apareceu em vários episódios da série de televisão Ugly Betty da ABC Network como Archie Rodriguez, um político local, com um papel semi-regular como o interesse amoroso de Hilda no programa. A partir de novembro de 2008, Macchio ficou no 80º lugar entre os 100 Melhores Estrelas Adolescentes de VH1.
Em junho de 2010, Macchio apareceu no curta online do Funny ou Die, “Wax On, F*ck Off”, no qual seus entes queridos encenaram uma intervenção para transformar a antiga estrela infantil de um homem de família bem ajustado em um viciado cercado de escândalo tablóide, tudo para ajudar na sua carreira. Durante o vídeo, Macchio reage a ver um cartaz para o remake do Karate Kid 2010. Uma piada recorrente no sketch é que Macchio está confuso para um adolescente. O curta foi elogiado pelo guia de TV Bruce Fretts, que se referiu ao vídeo como “sideplitting” e “ouro cômico”. Em 20 de setembro de 2010, Macchio interpretou o adulto Carl Morelli em uma leitura encenada da peça A Room of My Own de Charles Messina, apresentada pela Companhia de Teatro Bleecker Street. Em fevereiro de 2011 foi anunciado que ele iria competir no ABC’s Dancing with the Stars. Ele foi eliminado durante as semifinais, ficando em quarto lugar na competição geral. Macchio apareceu nos videoclipes da banda canadense Danko Jones para “Had Enough” e “I Think Bad Thoughts”, também com Elijah Wood e Jena Malone.
Em abril de 2012, Macchio foi elenco do filme Hitchcock, baseado no livro de não ficção Alfred Hitchcock and the Making of Psycho, co-estrelado por Anthony Hopkins, Helen Mirren, Scarlett Johansson, Jessica Biel e Toni Collette, e dirigido por Sacha Gervasi. Macchio retrata o roteirista Psycho Joseph Stefano. Em 2013, ele apareceu em How I Met Your Mother. O personagem principal, Barney Stinson, afirma que o personagem de Macchio, Daniel LaRusso, em The Karate Kid não é o verdadeiro karate kid; ao invés disso, é Johnny Lawrence, o nêmesis de Daniel no filme. No episódio da 8ª temporada “The Bro Mitzvah”, Macchio é convidado para a despedida de solteiro de Barney, embora Barney esteja desapontado com a surpresa, esperando o ator William Zabka, o “verdadeiro Karate Kid”. Durante o episódio, os personagens notam as semelhanças entre Barney e Macchio, para o desgosto de Barney. No final da noite, o palhaço contratado para o entretenimento da festa se revela como Zabka. De fevereiro a março de 2016, Macchio co-estrelou com Mario Cantone na produção Off-Broadway A Room of My Own, depois de ter lido a peça em 2010 e 2014.
Macchio está atualmente reprendendo seu papel como Daniel LaRusso em Cobra Kai, uma série de comédia de ação-drama Netflix apresentada em formato de narração de episódios, que começou em 2018. Ele também é co-produtor executivo da série, juntamente com William Zabka. A série é ambientada 34 anos após os eventos do All Valley Karate Tournament de 1984 e gira em torno de um Johnny Lawrence (Zabka) que – buscando retomar a vida e obter a redenção por sua derrota no torneio de 1984 – reabre o Cobra Kai dojo. Este reina a sua rivalidade com um LaRusso agora bem sucedido, que tem lutado para manter o equilíbrio na sua vida sem a orientação do seu agora falecido mentor, Sr. Miyagi.