Cu apariția șoarecilor modificați genetic, este acum posibil să se studieze fiecare dintre cele trei componente ale sistemului MCC (bătaia ciliară, producția de mucus și hidratarea suprafeței căilor respiratorii) în mod izolat pentru a determina modul în care acestea interacționează pentru a efectua o MCC normală. Cu toate acestea, esențială pentru capacitatea noastră de a înțelege interrelația dintre componentele sistemului MCC este capacitatea de a măsura cu exactitate rata MCC la șoareci.
În timp ce o serie de studii au măsurat MCC la șoareci printr-o varietate de tehnici, multe dintre studii au deficiențe tehnice și se raportează o gamă largă de rate MCC. Ratele de MCC traheal (sau de transport de particule) pentru „traheea normală de șoarece” raportate în literatura de specialitate diferă foarte mult, de la 15 mm/min6 la 0,031 mm/min21. O mare parte din variabilitatea raportată se datorează probabil diferențelor dintre tehnicile utilizate pentru măsurarea MCC, pe lângă alți factori (de exemplu, tulpina șoarecilor, vârsta etc.)8,14.
Unul dintre primele studii raportate a măsurat MCC în traheele intacte ale șoarecilor vii prin introducerea de bile fluorescente de ~3 μm în cavitatea nazală (volum de 15 µl) și apoi prin măsurarea transportului bilelor aspirate prin fluorescența trans-traheală a particulelor8. Acest studiu a constatat că mulți șoareci nu au prezentat MCC și că multe bile au prezentat un transport de tip „stop/go”. Acest studiu a constatat, de asemenea, că tulpina de șoareci studiată a influențat semnificativ rata de MCC. Alții au măsurat clearance-ul căilor respiratorii inferioare la șoarecele viu prin scintigrafie după instilarea unui volum mare (~50 μl) de emițător gamma în căile respiratorii9. Ambele studii suferă din cauza instilării unui volum relativ mare de lichid pe căile respiratorii și a perturbării volumului de lichid de la suprafața căilor respiratorii, care s-a demonstrat că modifică MCC8,13,22.
Există o serie de studii în literatura de specialitate în care MCC a fost măsurată în traheea murină deschisă21,23,24. Deși această tehnică MCC poate fi cea mai ușoară din punct de vedere tehnic, este probabil cea mai problematică din cauza dificultății de a menține temperatura și hidratarea normală a căilor respiratorii, ambele fiind extrem de importante pentru o MCC normală. Ratele MCC raportate pentru aceste preparate variază de la 0,031 mm/min până la 4,5 mm/min21,24. MCC la șoarece a fost, de asemenea, măsurată într-un preparat de plămân excizat25, dar această metodă a folosit, de asemenea, volume mari de lichid, similar cu preparatele cu trahee deschisă, cu inundarea marcată a plămânului excizat, ceea ce probabil perturbă MCC normală.
O tehnică de microdializă in vivo a fost utilizată cu succes pentru a identifica perturbările MCC datorate manipulării genetice în căile respiratorii inferioare la șoarece11. Această tehnică presupune plasarea unei sonde de microdializă foarte mici pe suprafața căilor respiratorii13 și un volum mic de trasor (250 nl) este adăugat distal în epiteliul căilor respiratorii. Timpul necesar pentru ca colorantul să ajungă la sondă este înregistrat și se calculează MCC. În timp ce această tehnică minimizează cantitatea de lichid exogen adăugat la suprafața căilor respiratorii, este oarecum consumatoare de timp, necesită plasarea unei mici deschideri în trahee, iar plasarea sondei poate perturba MCC.
O altă tehnică care a fost utilizată cu mare succes pentru a studia MCC pe un număr de șoareci modificați genetic implică plasarea unei cantități cunoscute de bile fluorescente într-o probă de lichid foarte mică (~150 nl) direct în traheea inferioară/bronhiile principale14,26,27,28. După 15 minute, se numără bilele rămase în trahee/bronhiile principale și se calculează procentul de eliminare. Deși se face doar o incizie foarte mică în traheea superioară pentru a introduce bilele, nu se poate afirma cu certitudine că mediul lichidian de la suprafața căilor respiratorii nu este perturbat de plasarea tranzitorie a canulei de administrare a bilelor sau de volumul mic de lichid utilizat pentru a introduce bilele. De asemenea, în timp ce aceste studii par să producă date bune privind clearance-ul și oferă diferențe clare în MCC între WT și șoarecii cu mutații care se așteaptă să perturbe MCC14,26,27,28, ratele reale de clearance nu sunt obținute cu această tehnică.
O tehnică mai optimă pentru a măsura MCC ar presupune introducerea unui trasor într-un șoarece viu fără deschiderea traheei și urmărirea trasorului prin traheea închisă. Acest lucru a fost raportat de Donnelley et al.16, dar tehnica lor a necesitat intubarea șoarecelui pentru a administra o pulbere uscată pentru urmărire și un echipament scump pentru imagistică (un sincrotron) care este disponibil doar în câteva locuri din lume. Utilizând această configurație, ratele bazale ale MCC au fost foarte scăzute (0,27 mm/min) și majoritatea particulelor au fost staționare, reflectând probabil desecarea căilor respiratorii, deoarece șoarecii intubați au fost ventilați cu un FlexVent și probabil au respirat aer uscat. Atunci când șoarecii au fost aerosolizați timp de 2,5 minute cu NaCl izotonic după insuflarea particulelor, rata de MCC a crescut semnificativ și a fost în intervalul de 2-3 mm/min, ceea ce nu este diferit de ceea ce am măsurat în prezenta investigație (media MCC cu NaCl izotonic în studiul nostru a fost de 3,3 mm/min).
A fost publicat recent un studiu în care imagistica in vivo fără intubație cu ajutorul microscopiei cu doi fotoni a fost utilizată pentru a măsura MCC la șoareci29. Într-adevăr, autorii au constatat că intubația a perturbat în mod semnificativ măsurarea precisă a MCC și, prin urmare, au concluzionat că această procedură ar trebui evitată în studiile privind MCC la murine. Astfel, ei au introdus trasorul în căile respiratorii prin aspirație orofaringiană folosind un volum relativ mare de lichid (20 µl). Similar cu ceea ce am observat în studiul nostru, Veres et al. raportează că bilele fluorescente (cu diametrul de 0,5 um) au format rafturi de agregate, pe care le-au urmărit pentru a determina rata globală a MCC (~1,1 mm/min). Deși metoda utilizată de Veres et al. pentru a pregăti traheea pentru vizualizare a fost foarte asemănătoare cu cea utilizată în studiile noastre, imagistica cu microscopia cu doi fotoni a necesitat un montaj mai elaborat și mai costisitor în comparație cu metoda noastră, care necesită doar un microscop de disecție interfațat cu o cameră CCD și iluminare fluorescentă.
Metoda noastră de măsurare a MCC livrează trasorul prin inhalare nazală a aerosolului, adăugând un volum foarte mic de lichid în căile respiratorii (0,095 µl/5-min de aerosol), iar traheea rămâne închisă și intactă pentru măsurătorile MCC. Este important faptul că am constatat că rata de MCC a fost aproape identică la șoarecii vii sau la scurt timp după eutanasiere. Acest lucru a fost destul de surprinzător, deoarece am speculat că eutanasia ar putea provoca o stimulare adrenergică (sau eliberarea altor neurotransmițători) care ar putea stimula MCC30. Absența excursiei respiratorii la șoarecii eutanasiați facilitează imagistica cu particule și, astfel, măsurătorile MCC pe un șoarece care nu trăiește pot fi mai ușoare din punct de vedere tehnic decât efectuarea unor astfel de măsurători pe un animal care respiră.
Nu am constatat niciun efect semnificativ al duratei anesteziei cu izofluran (5 sau 25 min) asupra ratei MCC. Majoritatea studiilor noastre au fost efectuate cu șoareci anesteziați cu izofluran, dar, deoarece accesul la un vaporizator dedicat ar putea să nu fie întotdeauna disponibil, iar administrarea simultană a izofluranului și a unui aerosol poate fi o provocare, am efectuat un set de studii folosind anestezicul injectabil, Avertin, care este disponibil pe scară largă și nu este reglementat de FDA, așa cum sunt multe anestezice injectabile. Rata de MCC nu a fost diferită între cele două anestezice. Deși numărul de rafturi de mărgele pe care le-am numărat la șoarecii anesteziați cu Avertin a fost ușor mai mic decât în grupul cu izofluran, această diferență nu a fost semnificativă. De remarcat, un număr semnificativ mai mare de mărgele au aderat la pereții traheali în grupul anesteziat cu izofluran, iar rafturile de mărgele la șoarecii Avertin au fost semnificativ mai mici decât cele de la șoarecii cu izofluran. Am emis ipoteza că aceste diferențe s-ar putea datora unor diferențe în ceea ce privește cantitatea de mărgele depuse în plămânii celor două grupuri de șoareci sau în modelul de depunere a acestora, mai ales că frecvența respiratorie și volumele tidale au fost diferite între șoarecii care au primit cele două anestezice.
Durata aerosolizării a avut un efect semnificativ asupra ratei de MCC și am stabilit că acest lucru s-a datorat masei de mărgele administrate, perioadele de aerosolizare mai scurte (5 min) dând rate mai mari de MCC decât aerosolizările mai lungi (15 min). Este puțin probabil ca o diferență în livrarea de lichid să explice rezultatele, deoarece șoarecii aerosolizați cu 1/3x mărgele timp de 15 min au primit de ~3 ori mai mult lichid decât șoarecii care au primit 1x mărgele timp de 5 min, iar ratele de MCC ale acestor două tratamente nu au fost diferite. De remarcat, diluarea suplimentară a perlelor de aerosoli (1/4x timp de 5 min, Fig. 5B) nu a dus la o creștere suplimentară a MCC. Astfel, dacă sunt aerosolizate prea multe bile, se pare că acestea copleșesc procesul de transport și multe dintre ele nu se elimină. Cu toate acestea, chiar și atunci când o masă optimă de bile a fost aerosolizată pe căile respiratorii, unele dintre bile au aderat la pereți în multe dintre preparate. Numeroși alți cercetători au raportat eșecul eliminării bilelor/particulelor în traheea murină8,16,29.
În schimb, în timp ce dimensiunea și formele plutoanelor de bile au fost variabile în cadrul unui șoarece și între șoareci, nu am detectat o diferență în rata de transport în funcție de dimensiunea plutoanelor. Alții au observat, de asemenea, că MCC a fost independentă de mărimea și forma particulelor, dar a fost influențată de proprietatea materială a particulelor transportate31,32.
S-a raportat că soluția salină hipertonică crește volumul lichidului de la suprafața căilor respiratorii prin atragerea osmotică a lichidului în căile respiratorii și a fost utilizată clinic pentru a restabili/accelera MCC18,19. Deși nu am observat un efect semnificativ al salinității ridicate asupra ratei MCC, am observat că rata MCC a fost menținută pentru perioada de măsurare de 10 minute în grupul cu salinitate ridicată, în timp ce rata MCC a scăzut după 5 minute în grupul de control. Aceste date sunt similare cu cele raportate de Donnelley et al.16, care au observat că, deși grupul lor cu conținut ridicat de sare nu a prezentat o rată mai mare de MCC în comparație cu controalele tratate cu soluție salină izotonică, rata de MCC a fost menținută pentru perioade mai lungi în grupul cu conținut ridicat de sare, sugerând o creștere temporară a hidratării suprafeței căilor respiratorii. De remarcat, studiile lui Donnelley et al. au fost efectuate în prezența unui blocant al canalelor Na+ adăugat la grupul cu nivel ridicat de sare. Deoarece studiile noastre au fost efectuate fără adăugarea unui blocant al canalelor Na+, acest lucru susține ipoteza că soluția salină hipertonică în sine poate restabili scăderea ușoară a MCC observată după o aerosolizare de 5 minute cu soluție salină izotonică. Nu este clar de ce au fost numărate mai puține rafturi de bile în grupul cu salinitate ridicată, deoarece nu părea să existe mai multe particule staționare și nici o diferență în ceea ce privește dimensiunea rafturilor în comparație cu grupul izotonic de 5 minute.
Acum s-a demonstrat că nucleotidele cresc MCC prin creșterea CBF, a lichidului de la suprafața căilor respiratorii și a secreției de mucus33, am investigat efectul UTP atunci când a fost inclus în aerosolul izotonic de 5 minute împreună cu bilele de urmărire. Am constatat că un aerosol de 5 minute de UTP a crescut semnificativ rata de eliminare a bilelor, sugerând că o doză de UTP suficientă pentru a modifica MCC a fost aerosolizată la suprafața căilor respiratorii. Pe baza studiilor anterioare, este probabil ca toate cele trei componente ale sistemului de eliminare mucociliară (frecvența bătăilor ciliare, secreția de mucină și hidratarea suprafeței căilor respiratorii) să fi fost stimulate de UTP pentru a duce la o creștere generală a MCC. Astfel, tehnica noastră va fi deosebit de utilă pentru testarea diferitelor preparate farmacologice care pot afecta MCC.
În cele din urmă, metoda noastră de aerosolizare a fost utilizată pentru a măsura cu succes MCC la puii de șoarece neonatali de 10 zile. Astfel, această metodă va fi utilă pentru a studia MCC în timpul dezvoltării sau în modelele de boală în care s-a constatat că unele dintre mutațiile care perturbă MCC au ca rezultat letalitatea neonatală11,28.
În concluzie, am dezvoltat o metodă simplă și ieftină pentru a determina MCC la șoareci in vivo (a se vedea tabelul suplimentar S1 pentru parametrii optimi pentru măsurătorile MCC, așa cum au fost determinați în acest studiu). Metoda noastră utilizează aerosolizarea și urmărirea transtraheală a bilelor fluorescente pentru determinarea MCC și prezintă o serie de avantaje față de alte metode MCC raportate în literatura de specialitate. În primul rând, traheea nu trebuie să fie deschisă (sau intubată) pentru introducerea trasorului și doar un volum foarte mic de lichid este inhalat cu bilele de trasor, reducând probabilitatea de a perturba mediul lichidului de la suprafața căilor respiratorii. În al doilea rând, putem vizualiza, de fapt, comportamentul bilelor în timpul eliminării, ceea ce poate oferi informații suplimentare despre modificările introduse de o anumită intervenție, de exemplu, modelele de migrare, aglomerarea și/sau devierea de la traiectorii uniforme, pe lângă o rată reală a MCC. În al treilea rând, am utilizat cu succes această metodă pentru a studia MCC la puii de șoarece foarte tineri. Mai mult, deoarece această metodă nu este neapărat terminală, ea poate fi realizată pe șoareci vii și poate fi utilizată pentru a studia MCC înainte și după tratamentul medicamentos. În plus, obținem rate aproape identice de MCC pe șoareci vii sau post-eutanasiere. În cele din urmă, echipamentul necesar pentru aceste studii este relativ ieftin și ușor de obținut și sperăm că va permite laboratoarelor care studiază perturbațiile în componentele sistemului MCC să măsoare efectiv MCC la acești șoareci.
.