S příchodem geneticky upravených myší, je nyní možné studovat každou ze tří složek systému MCC (ciliární rytmus, produkci hlenu a hydrataci povrchu dýchacích cest) izolovaně, aby bylo možné určit, jak vzájemně ovlivňují normální MCC. Pro pochopení vzájemných vztahů mezi jednotlivými složkami systému MCC je však zásadní schopnost přesně měřit rychlost MCC u myší.
Přestože řada studií měřila rychlost MCC u myší různými technikami, mnohé z těchto studií mají technické nedostatky a uvádí se široký rozsah rychlosti MCC. Rychlosti tracheální MCC (nebo transportu částic) pro „normální myší tracheu“ uváděné v literatuře se značně liší od 15 mm/min6 do 0,031 mm/min21. Velká část uváděné variability je pravděpodobně způsobena rozdíly v technikách používaných k měření MCC a dalšími faktory (např. kmen myší, věk atd.)8,14.
Jedna z prvních uváděných studií měřila MCC v intaktních tracheích živých myší zavedením fluorescenčních kuliček o velikosti ~3 μm do nosní dutiny (objem 15 µl) a následným měřením transportu nasátých kuliček pomocí transtracheální fluorescence částic8. Tato studie zjistila, že mnoho myší nevykazovalo žádný MCC a mnoho kuliček vykazovalo transport typu „stop/go“. Tato studie také zjistila, že studovaný kmen myší významně ovlivňuje míru MCC. Jiní měřili nižší clearance dýchacích cest u živé myši pomocí scintigrafie po vpravení velkého objemu (~50 μl) gama zářiče do dýchacích cest9. Obě tyto studie trpí instilací relativně velkého objemu kapaliny do dýchacích cest a narušením objemu kapaliny na povrchu dýchacích cest, což prokazatelně mění MCC8,13,22.
V literatuře existuje řada studií, ve kterých byla měřena MCC v otevřené myší průdušnici21,23,24 . Tato technika měření MCC je sice technicky nejjednodušší, ale pravděpodobně nejproblematičtější vzhledem k obtížím při udržování teploty a normální hydratace dýchacích cest, které jsou pro normální MCC kriticky důležité. Rychlost MCC uváděná pro tyto přípravky se pohybuje od 0,031 mm/min do 4,5 mm/min21,24. MCC u myší byla měřena také v preparátu z excidované plíce25 , ale i tato metoda používala velké objemy tekutiny, podobně jako preparáty z otevřené trachey s výrazným zaplavením excidované plíce, což pravděpodobně narušuje normální MCC.
K identifikaci poruch MCC v důsledku genetické manipulace v dolních dýchacích cestách u myší byla úspěšně použita technika mikrodialýzy in vivo11. Tato technika zahrnuje umístění velmi malé mikrodialyzační sondy na povrch dýchacích cest13 a malý objem traceru (250 nl) je přidán distálně k epitelu dýchacích cest. Zaznamená se čas potřebný k tomu, aby barvivo dosáhlo sondy, a vypočítá se MCC. Tato technika sice minimalizuje množství exogenní kapaliny přidané na povrch dýchacích cest, ale je poněkud časově náročná, vyžaduje umístění malého otvoru v průdušnici a umístění sondy může narušit MCC.
Další technika, která byla velmi úspěšně použita ke studiu MCC na řadě geneticky modifikovaných myší, zahrnuje umístění známého množství fluorescenčních kuliček do velmi malého vzorku kapaliny (~150 nl) přímo do dolní části průdušnice/základních průdušek14,26,27,28 . Po 15 minutách se spočítají kuličky, které zůstaly v průdušnici/pramenových průduškách, a vypočítá se procentuální clearance. Přestože je pro zavedení kuliček proveden pouze velmi malý řez v horní části průdušnice, nelze s jistotou tvrdit, že prostředí tekutiny na povrchu dýchacích cest není narušeno přechodným umístěním kanyly pro podávání kuliček nebo malým objemem tekutiny použitým pro zavedení kuliček. Ačkoli se zdá, že tyto studie poskytují dobré údaje o clearance a poskytují jasné rozdíly v MCC mezi WT a myšmi s mutacemi, u nichž se očekává narušení MCC14,26,27,28 , skutečnou míru clearance touto technikou nezískáme.
Optimálnější technika měření MCC by zahrnovala zavedení traceru u živé myši bez otevření průdušnice a sledování traceru uzavřenou průdušnicí. O této technice informovali Donnelley a spol.16 , ale jejich technika vyžadovala intubaci myši za účelem dodání suchého prášku pro sledování a drahé vybavení pro zobrazování (synchrotron), které je dostupné pouze na několika místech na světě. Při použití tohoto uspořádání byla základní rychlost MCC velmi nízká (0,27 mm/min) a většina částic byla stacionární, což pravděpodobně odráželo vysychání dýchacích cest, protože intubované myši byly ventilovány ventilátorem FlexVent a pravděpodobně dýchaly suchý vzduch. Když byly myši po insuflaci částic po dobu 2,5 minuty aerosolovány izotonickým NaCl, rychlost MCC se výrazně zvýšila a pohybovala se v rozmezí 2-3 mm/min, což se neliší od toho, co jsme naměřili v tomto šetření (průměrná MCC s izotonickým NaCl v naší studii byla 3,3 mm/min).
Nedávno byla publikována studie, ve které bylo k měření MCC u myší použito bezintubační zobrazování in vivo pomocí dvoufotonové mikroskopie29. Autoři skutečně zjistili, že intubace výrazně narušuje přesné měření MCC, a proto dospěli k závěru, že je třeba se tomuto postupu ve studiích MCC na myších vyhnout. Proto zavedli stopovací látku do dýchacích cest orofaryngeální aspirací za použití relativně velkého objemu tekutiny (20 µl). Podobně jako v naší studii Veres a spol. uvádějí, že fluorescenční kuličky (o průměru 0,5 um) vytvořily agregované rafty, které sledovali, aby určili celkovou rychlost MCC (~1,1 mm/min). Ačkoli metoda použitá Veresem et al. k přípravě trachey pro vizualizaci byla velmi podobná té, kterou jsme použili v naší studii, zobrazování pomocí dvoufotonové mikroskopie vyžadovalo složitější a nákladnější sestavu ve srovnání s naší metodou, která vyžaduje pouze pitevní dalekohled propojený s CCD kamerou a fluorescenčním osvětlením.
Naše metoda měření MCC dodává stopovací látku prostřednictvím inhalace nosního aerosolu, čímž se do dýchacích cest přidává velmi malý objem tekutiny (0,095 µl/5 min aerosolu) a průdušnice zůstává při měření MCC uzavřená a neporušená. Důležité je, že jsme zjistili, že míra MCC je téměř totožná u živých myší nebo krátce po eutanazii. To bylo poměrně překvapivé, protože jsme předpokládali, že eutanazie může způsobit adrenergní stimulaci (nebo uvolnění jiných neurotransmiterů), která by mohla stimulovat MCC30. Absence dechové exkurze u eutanazovaných myší usnadňuje zobrazování částic, a proto může být měření MCC na neživé myši technicky jednodušší než provádění takových měření na dýchajícím zvířeti.
Nezjistili jsme žádný významný vliv délky isofluranové anestezie (5 nebo 25 min) na rychlost MCC. Většina našich studií byla provedena na myších anestezovaných isofluranovou anestezií, ale protože přístup ke speciálnímu odpařovači nemusí být vždy k dispozici a současné podání isofluranu a aerosolu může být náročné, provedli jsme soubor studií s použitím injekčního anestetika Avertin, které je široce dostupné a není regulováno FDA, stejně jako mnoho injekčních anestetik. Míra výskytu MCC se u obou anestetik nelišila. Ačkoli počet korálkových raftů, které jsme spočítali u myší anestezovaných Averetinem, byl o něco nižší než u skupiny s isofluranem, tento rozdíl nebyl významný. Za zmínku stojí, že ve skupině anestezované isofluranem přilnulo ke stěnám trachey výrazně více kuliček a že kuličkové rafty u myší anestezovaných Averenem byly výrazně menší než u myší anestezovaných isofluranem. Předpokládáme, že tyto rozdíly mohou být způsobeny rozdíly v množství kuliček uložených v plicích obou skupin myší nebo ve způsobu jejich ukládání, zejména proto, že dechová frekvence a dechové objemy se u myší, které dostávaly obě anestetika, lišily.
Délka aerosolizace měla významný vliv na míru MCC a my jsme určili, že to bylo způsobeno hmotností dodaných kuliček, přičemž kratší doba aerosolizace (5 min) vedla k vyšší míře MCC než delší aerosolizace (15 min). Je nepravděpodobné, že by rozdíl v dodávce kapaliny vysvětloval výsledky, protože myši aerosolované 1/3x kuličkami po dobu 15 min dostaly ~3krát více kapaliny než myši, které dostávaly 1x kuličky po dobu 5 min, a míra MCC těchto dvou ošetření se nelišila. Za zmínku stojí, že další ředění aerosolových kuliček (1/4x po dobu 5 min, obr. 5B) nevedlo k dalšímu zvýšení MCC. Zdá se tedy, že pokud je aerosolových kuliček příliš mnoho, zahltí transportní proces a mnoho z nich se neodstraní. Nicméně i když byla na dýchací cesty aerosolována optimální hmotnost kuliček, v mnoha preparátech část kuliček ulpěla na stěnách. Řada jiných badatelů zaznamenala, že kuličky/částice se v myší průdušnici nevyklízí8,16,29.
Naproti tomu, i když se velikost a tvar raftů s kuličkami lišily v rámci jedné myši i mezi jednotlivými myšmi, nezjistili jsme rozdíl v rychlosti transportu v závislosti na velikosti raftů. Jiní také zaznamenali, že MCC byla nezávislá na velikosti a tvaru částic, ale byla ovlivněna vlastnostmi materiálu transportovaných částic31,32.
Bylo zjištěno, že hypertonický roztok zvětšuje objem tekutiny na povrchu dýchacích cest osmotickým vtahováním tekutiny do dýchacích cest a byl klinicky používán k obnovení/urychlení MCC18,19 . I když jsme nezaznamenali významný vliv vysokého obsahu soli na rychlost MCC, zaznamenali jsme, že rychlost MCC se ve skupině s vysokým obsahem soli udržela po dobu 10 minut měření, zatímco v kontrolní skupině se rychlost MCC po 5 minutách snížila. Tyto údaje jsou podobné údajům, které uvádí Donnelley a spol.16 , kteří pozorovali, že ačkoli jejich skupina s vysokým obsahem soli nevykazovala vyšší míru MCC ve srovnání s kontrolní skupinou léčenou izotonickým roztokem, míra MCC se ve skupině s vysokým obsahem soli udržovala po delší dobu, což naznačuje dočasné zvýšení hydratace povrchu dýchacích cest. Za zmínku stojí, že studie Donnelleyho a spol. byly provedeny za přítomnosti blokátoru Na+ kanálů, který byl přidán skupině s vysokým obsahem soli. Vzhledem k tomu, že naše studie byly provedeny bez přídavku blokátoru Na+ kanálů, podporuje to hypotézu, že hypertonický roztok jako takový může obnovit mírný pokles MCC pozorovaný po 5minutové aerosolizaci izotonickým roztokem. Není jasné, proč bylo ve skupině s vysokým obsahem soli napočítáno méně raftů z kuliček, protože se nezdá, že by zde bylo více stacionárních částic ani rozdíl ve velikosti raftů ve srovnání s 5minutovou izotonickou skupinou.
Jelikož bylo prokázáno, že nukleotidy zvyšují MCC zvýšením CBF, tekutiny na povrchu dýchacích cest a sekrece hlenu33 , zkoumali jsme účinek UTP, pokud byl zahrnut do izotonického 5minutového aerosolu spolu se stopovacími kuličkami. Zjistili jsme, že 5minutový aerosol UTP významně zvýšil rychlost clearance kuliček, což naznačuje, že na povrch dýchacích cest se aerosolem dostala dávka UTP dostatečná k modifikaci MCC. Na základě předchozích studií je pravděpodobné, že všechny tři složky mukociliárního clearance systému (frekvence ciliárních kmitů, sekrece mucinu a hydratace povrchu dýchacích cest) byly stimulovány UTP, což vedlo k celkovému zvýšení MCC. Naše technika tak bude užitečná zejména pro testování různých farmakologických přípravků, které mohou ovlivňovat MCC.
Nakonec byla naše aerosolová metoda úspěšně použita k měření MCC u desetidenních novorozených myších mláďat. Tato metoda tak bude užitečná při studiu MCC během vývoje nebo u modelů onemocnění, u nichž bylo zjištěno, že některé mutace, které narušují MCC, vedou k neonatální letalitě11,28.
V souhrnu jsme vyvinuli jednoduchou a levnou metodu pro stanovení MCC u myší in vivo (optimální parametry pro měření MCC stanovené v této studii viz doplňková tabulka S1). Naše metoda využívá ke stanovení MCC aerosolizaci a transtracheální sledování fluorescenčních kuliček a má řadu výhod oproti jiným metodám stanovení MCC uváděným v literatuře. Za prvé, trachea nemusí být pro zavedení stopovací látky otevřena (nebo intubována) a se stopovacími kuličkami je vdechován pouze velmi malý objem tekutiny, což snižuje pravděpodobnost narušení prostředí tekutiny na povrchu dýchacích cest. Za druhé, můžeme skutečně vizualizovat chování kuliček během clearance, což může kromě skutečné rychlosti MCC poskytnout další informace o změnách zavedených konkrétním zásahem, tj. vzorcích migrace, shlukování a/nebo odchylkách od rovnoměrných trajektorií. Zatřetí jsme tuto metodu úspěšně použili ke studiu MCC u velmi mladých myších mláďat. Navíc, protože tato metoda není nutně terminální, lze ji provádět na živých myších a lze ji použít ke studiu MCC před a po léčbě léky. Kromě toho jsme získali téměř identickou míru MCC na živých myších nebo myších po eutanazii. V neposlední řadě je vybavení potřebné pro tyto studie relativně levné a snadno dostupné a doufejme, že umožní laboratořím, které studují poruchy ve složkách systému MCC, skutečně měřit MCC u těchto myší.