Dzięki pojawieniu się genetycznie modyfikowanych myszy, możliwe jest obecnie badanie każdego z trzech elementów systemu MCC (bicie rzęsek, produkcja śluzu i nawilżenie powierzchni dróg oddechowych) w odosobnieniu w celu określenia ich wzajemnego oddziaływania na prawidłowe MCC. Jednakże, krytyczna dla naszej zdolności do zrozumienia wzajemnych powiązań pomiędzy komponentami systemu MCC jest możliwość dokładnego pomiaru szybkości MCC u myszy.
Pomimo, że wiele badań mierzyło MCC u myszy przy użyciu różnych technik, wiele z nich ma techniczne niedociągnięcia i zgłaszany jest szeroki zakres szybkości MCC. Wskaźniki MCC (lub transportu cząsteczek) dla „normalnej tchawicy myszy” podane w literaturze różnią się znacznie od 15 mm/min6 do 0,031 mm/min21. Duża część podawanej zmienności jest prawdopodobnie spowodowana różnicami w technikach stosowanych do pomiaru MCC, oprócz innych czynników (np. szczep myszy, wiek, itp.) 8,14.
Jedno z najwcześniejszych opisanych badań mierzyło MCC w nienaruszonych tchawicach żywych myszy, wprowadzając kulki fluorescencyjne o wielkości ~3 μm do jamy nosowej (objętość 15 µl), a następnie mierząc transport zaaspirowanych kulek poprzez przeztchawiczą fluorescencję cząstek8. Badanie to wykazało, że wiele myszy nie wykazywało MCC, a wiele kulek wykazywało transport typu „stop/go”. Badanie to wykazało również, że szczep badanych myszy znacząco wpłynął na szybkość MCC. Inni mierzyli niższy klirens dróg oddechowych u żywych myszy za pomocą scyntygrafii po wprowadzeniu dużej objętości (~50 μl) emiterów gamma do dróg oddechowych9. Oba te badania cierpią z powodu wprowadzenia stosunkowo dużej objętości płynu do dróg oddechowych i zaburzenia objętości płynu na powierzchni dróg oddechowych, co, jak wykazano, zmienia MCC8,13,22.
W literaturze istnieje szereg badań, w których MCC mierzono w otwartej tchawicy myszy21,23,24. Chociaż ta technika MCC może być technicznie najłatwiejsza, jest ona prawdopodobnie najbardziej problematyczna ze względu na trudności w utrzymaniu temperatury i prawidłowego nawilżenia dróg oddechowych, z których oba są krytycznie ważne dla prawidłowego MCC. Szybkość MCC zgłaszana dla tych preparatów wynosi od 0,031 mm/min do 4,5 mm/min21,24. MCC u myszy było również mierzone w preparacie z wyciętym płucem25, ale ta metoda również wykorzystywała duże objętości płynu, podobnie jak w przypadku preparatów z otwartą tchawicą, z wyraźnym zalewaniem wyciętego płuca, co prawdopodobnie zaburza prawidłowe MCC.
Technika mikrodializy in vivo była z powodzeniem stosowana do identyfikacji perturbacji w MCC spowodowanych manipulacjami genetycznymi w dolnych drogach oddechowych u myszy11. Technika ta polega na umieszczeniu bardzo małej sondy mikrodializacyjnej na powierzchni dróg oddechowych13 , a niewielka objętość znacznika (250 nl) jest dodawana dystalnie do nabłonka dróg oddechowych. Czas potrzebny na dotarcie barwnika do sondy jest rejestrowany i obliczany jest MCC. Chociaż technika ta minimalizuje ilość egzogennego płynu dodawanego do powierzchni dróg oddechowych, jest ona nieco czasochłonna, wymaga wykonania małego otworu w tchawicy, a umieszczenie sondy może zaburzać MCC.
Inna technika, która została zastosowana z dużym powodzeniem do badania MCC u wielu genetycznie zmodyfikowanych myszy, polega na umieszczeniu znanej ilości kulek fluorescencyjnych w bardzo małej próbce płynu (~150 nl) bezpośrednio w dolnej tchawicy/głównym oskrzelu14,26,27,28. Po 15 minutach liczy się kulki pozostające w tchawicy/głównym oskrzelu i oblicza się procentowy klirens. Chociaż w celu wprowadzenia kulek wykonuje się tylko bardzo małe nacięcie w górnej części tchawicy, nie można z całą pewnością stwierdzić, że środowisko płynowe powierzchni dróg oddechowych nie jest zakłócone przez przejściowe umieszczenie kaniuli do podawania kulek lub małą objętość płynu użytego do wprowadzenia kulek. Ponadto, podczas gdy badania te wydają się przynosić dobre dane dotyczące klirensu i zapewniają wyraźne różnice w MCC między WT i myszami z mutacjami, które prawdopodobnie zaburzają MCC14,26,27,28, rzeczywiste wskaźniki klirensu nie są uzyskiwane za pomocą tej techniki.
Najbardziej optymalna technika pomiaru MCC obejmowałaby wprowadzenie znacznika u żywej myszy bez otwierania tchawicy i śledzenia znacznika przez zamkniętą tchawicę. Zostało to zgłoszone przez Donnelley i wsp.16, ale ich technika wymagała intubacji myszy w celu dostarczenia suchego proszku do śledzenia i drogiego sprzętu do obrazowania (synchrotron), który jest dostępny tylko w kilku miejscach na świecie. Przy takim ustawieniu podstawowa szybkość MCC była bardzo niska (0,27 mm/min), a większość cząstek była nieruchoma, co prawdopodobnie odzwierciedlało osuszenie dróg oddechowych, ponieważ zaintubowane myszy były wentylowane za pomocą FlexVent i prawdopodobnie oddychały suchym powietrzem. Kiedy myszy były aerozolowane przez 2,5 minuty izotonicznym NaCl po insuflacji cząsteczek, szybkość MCC znacznie wzrosła i mieściła się w zakresie 2-3 mm/min, nie różniąc się od tego, co zmierzyliśmy w obecnym badaniu (średnia MCC z izotonicznym NaCl w naszym badaniu wynosiła 3,3 mm/min).
Ostatnio opublikowano badanie, w którym do pomiaru MCC u myszy wykorzystano obrazowanie in vivo bez intubacji przy użyciu mikroskopii dwufotonowej29. Autorzy stwierdzili, że intubacja znacząco zaburza dokładny pomiar MCC i w związku z tym uznali, że należy unikać tej procedury w badaniach MCC u myszy. Dlatego też wprowadzili oni znacznik do dróg oddechowych poprzez aspirację ustno-gardłową, używając stosunkowo dużej objętości płynu (20 µl). Podobnie jak w naszym badaniu, Veres i wsp. podają, że fluorescencyjne kulki (o średnicy 0,5 um) tworzyły zagregowane tratwy, które śledzili w celu określenia ogólnej szybkości MCC (~1,1 mm/min). Chociaż metoda zastosowana przez Veres i wsp. do przygotowania tchawicy do wizualizacji była bardzo podobna do tej stosowanej w naszych badaniach, obrazowanie za pomocą mikroskopii dwufotonowej wymagało bardziej skomplikowanego i kosztownego ustawienia w porównaniu z naszą metodą, która wymaga jedynie lunety dysekcyjnej połączonej z kamerą CCD i oświetleniem fluorescencyjnym.
Nasza metoda pomiaru MCC dostarcza znacznik poprzez inhalację aerozolu donosowego, dodając bardzo małą objętość płynu do dróg oddechowych (0.095 µl/5-min aerozol), a tchawica pozostaje zamknięta i nienaruszona podczas pomiarów MCC. Co ważne, stwierdziliśmy, że szybkość MCC była niemal identyczna u żywych myszy lub tuż po eutanazji. Było to dość zaskakujące, ponieważ spekulowaliśmy, że eutanazja może powodować stymulację adrenergiczną (lub uwalnianie innych neuroprzekaźników), które mogą stymulować MCC30. Brak wydechu u eutanazowanych myszy ułatwia obrazowanie cząstek, a zatem pomiary MCC na nieżyjącej myszy mogą być technicznie łatwiejsze niż wykonywanie takich pomiarów na oddychającym zwierzęciu.
Nie znaleźliśmy znaczącego wpływu długości znieczulenia izofluranem (5 lub 25 minut) na szybkość MCC. Większość naszych badań przeprowadzono z myszami znieczulonymi izofluranem, ale ponieważ dostęp do dedykowanego parownika może nie zawsze być możliwy, a jednoczesne podawanie izofluranu i aerozolu może być wyzwaniem, przeprowadziliśmy zestaw badań z użyciem anestetyku do wstrzykiwania, Avertin, który jest powszechnie dostępny i nie jest regulowany przez FDA, podobnie jak wiele anestetyków do wstrzykiwania. Tempo MCC nie różniło się pomiędzy tymi dwoma anestetykami. Chociaż liczba tratw paciorków, które policzyliśmy u myszy znieczulonych Averetinem była nieco mniejsza niż w grupie z izofluranem, różnica ta nie była znacząca. Warto zauważyć, że znacznie więcej paciorków przylegało do ścian tchawicy w grupie znieczulanej izofluranem, a tratwy paciorków u myszy z Awertyną były znacznie mniejsze niż u myszy z izofluranem. Postawiliśmy hipotezę, że różnice te mogą wynikać z różnic w ilości paciorków zdeponowanych w płucach dwóch grup myszy lub w ich wzorze depozycji, zwłaszcza że częstość oddechów i objętości oddechowe różniły się między myszami otrzymującymi dwa anestetyki.
Długość aerozolizacji miała znaczący wpływ na szybkość MCC i ustaliliśmy, że było to spowodowane masą dostarczonych kulek, przy czym krótsze okresy aerozolizacji (5 min) dawały większe szybkości MCC niż dłuższe aerozolizacje (15 min). Jest mało prawdopodobne, że różnica w dostarczaniu płynu wyjaśnia te wyniki, ponieważ myszy aerozolizowane kulkami 1/3x przez 15 min otrzymywały ~3 razy więcej płynu niż myszy otrzymujące kulki 1x przez 5 min, a wskaźniki MCC dla tych dwóch metod leczenia nie różniły się. Należy zauważyć, że dalsze rozcieńczanie kulek w aerozolu (1/4x przez 5 min, ryc. 5B) nie spowodowało dalszego wzrostu MCC. Tak więc, jeśli zbyt wiele kulek jest rozpylanych w aerozolu, wydają się one przytłaczać proces transportu i wiele z nich nie zostaje oczyszczonych. Jednakże, nawet gdy optymalna masa kulek została rozpylona na drogi oddechowe, niektóre z nich przylegały do ścian w wielu preparatach. Wielu innych badaczy zgłosiło, że kulki / cząstki nie są w stanie oczyścić tchawicy u myszy8,16,29.
W przeciwieństwie do tego, podczas gdy rozmiar i kształty tratw z koralikami były zmienne w obrębie myszy i między myszami, nie wykryliśmy różnicy w szybkości transportu w funkcji rozmiaru tratwy. Inni również zauważyli, że MCC był niezależny od rozmiaru i kształtu cząstek, ale był pod wpływem właściwości materiału transportowanych cząstek31,32.
Zgłaszano, że sól hipertoniczna zwiększa objętość cieczy powierzchniowej dróg oddechowych poprzez osmotyczne wciąganie cieczy do dróg oddechowych i była stosowana klinicznie w celu przywrócenia/przyspieszenia MCC18,19. Chociaż nie zaobserwowaliśmy znaczącego wpływu wysokiej soli na tempo MCC, zauważyliśmy, że tempo MCC utrzymywało się przez 10-minutowy okres pomiaru w grupie z wysoką solą, podczas gdy tempo MCC spadło po 5 minutach w grupie kontrolnej. Dane te są podobne do tych przedstawionych przez Donnelley i wsp.16, którzy zaobserwowali, że chociaż ich grupa otrzymująca wysokie stężenie soli nie wykazywała większego tempa MCC w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą izotoniczny roztwór soli, tempo MCC utrzymywało się przez dłuższy czas w grupie otrzymującej wysokie stężenie soli, co sugeruje tymczasowy wzrost nawilżenia powierzchni dróg oddechowych. Należy zauważyć, że badania Donnelley i wsp. zostały przeprowadzone w obecności blokera kanału Na+ dodanego do grupy otrzymującej wysokie stężenie soli. Ponieważ nasze badania zostały przeprowadzone bez dodatku blokera kanału Na+, potwierdza to hipotezę, że sól hipertoniczna per se może przywrócić niewielki spadek MCC obserwowany po 5-minutowej aerozoloterapii izotoniczną solą fizjologiczną. Nie jest jasne, dlaczego mniej tratw paciorków zostało policzonych w grupie o wysokiej zawartości soli, ponieważ nie wydaje się, aby było więcej cząstek stacjonarnych lub różnica w wielkości tratw w porównaniu z 5-minutową grupą izotoniczną.
Jako że wykazano, że nukleotydy zwiększają MCC poprzez zwiększenie CBF, płynu w drogach oddechowych i wydzielania śluzu33, zbadaliśmy wpływ UTP, gdy jest on zawarty w izotonicznym 5-minutowym aerozolu wraz z kulkami śledzącymi. Stwierdziliśmy, że 5-minutowy aerozol UTP znacznie zwiększył szybkość usuwania paciorków, co sugeruje, że dawka UTP wystarczająca do modyfikacji MCC została rozpylona na powierzchnie dróg oddechowych. Na podstawie poprzednich badań, jest prawdopodobne, że wszystkie trzy elementy systemu klirensu śluzówkowo-rzęskowego (częstotliwość uderzeń rzęsek, wydzielanie mucyny i nawilżenie powierzchni dróg oddechowych) były stymulowane przez UTP, co spowodowało ogólny wzrost MCC. Tak więc nasza technika będzie szczególnie przydatna do badania różnych preparatów farmakologicznych, które mogą wpływać na MCC.
Wreszcie, nasza metoda aerozolizacji została z powodzeniem zastosowana do pomiaru MCC u 10-dniowych szczeniąt noworodków myszy. Tak więc metoda ta będzie przydatna do badania MCC podczas rozwoju lub w modelach chorobowych, w których niektóre mutacje, które zaburzają MCC, spowodowały śmiertelność noworodków11,28.
Podsumowując, opracowaliśmy prostą, niedrogą metodę oznaczania MCC u myszy in vivo (patrz Tabela uzupełniająca S1 dla optymalnych parametrów do pomiarów MCC określonych w tym badaniu). Nasza metoda wykorzystuje aerozolizację i śledzenie przez tchawicę kulek fluorescencyjnych do oznaczania MCC i ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami MCC opisanymi w literaturze. Po pierwsze, tchawica nie musi być otwarta (lub zaintubowana) w celu wprowadzenia znacznika, a tylko bardzo mała objętość płynu jest wdychana wraz z kulkami znacznika, co zmniejsza prawdopodobieństwo zakłócenia środowiska płynu powierzchniowego dróg oddechowych. Po drugie, możemy wizualizować zachowanie się kulek podczas oczyszczania, co może dostarczyć dodatkowych informacji na temat zmian wprowadzonych przez konkretną interwencję, tj. wzorce migracji, zlepianie się i/lub odchylenia od jednolitych trajektorii, oprócz rzeczywistego tempa MCC. Po trzecie, z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do badania MCC u bardzo młodych szczeniąt myszy. Ponadto, ponieważ metoda ta nie jest koniecznie terminalna, może być wykonywana na żywych myszach i może być używana do badania MCC przed i po leczeniu farmakologicznym. Dodatkowo, uzyskujemy prawie identyczne wskaźniki MCC na żywych lub po eutanazji myszach. Wreszcie, sprzęt wymagany do tych badań jest stosunkowo niedrogi i łatwo dostępny i miejmy nadzieję, że pozwoli laboratoriom badającym perturbacje w składnikach systemu MCC na rzeczywiste mierzenie MCC u tych myszy.
.